3D生物打印基質(zhì)中神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的多尺度構(gòu)建與功能研究

來(lái)源：EFL生物3D打印與生物制造

在神經(jīng)科學(xué)研究中，高效建立能準(zhǔn)確模擬神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和功能連接的體外模型至關(guān)重要，3D生物打印技術(shù)雖潛力巨大，但成熟神經(jīng)元脆弱易受操作影響，且此前3D生物打印原代神經(jīng)細(xì)胞存在存活率低、分析不全面等問(wèn)題，構(gòu)建具有多尺度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織的功能性原代神經(jīng)組織是主要挑戰(zhàn)。來(lái)自北京協(xié)和醫(yī)院馬文斌、毛一雷教授團(tuán)隊(duì)，利用擠出式3D生物打印技術(shù)，優(yōu)化打印參數(shù)和模型設(shè)計(jì)，采用明膠甲基丙烯酰（GelMA）構(gòu)建了包含E18大鼠皮層神經(jīng)元的3D neuMatrix，該模型具有良好神經(jīng)元存活率，能形成具有局部和長(zhǎng)距離功能軸突連接的3D腦樣神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，還可用于缺血性中風(fēng)等疾病建模。相關(guān)工作以“Multiscale Organization of Neural Networks in a 3D Bioprinted Matrix”為題發(fā)表在《Advanced Science》上。

研究?jī)?nèi)容
通過(guò)擠出式3D生物打印技術(shù)，將胚胎18天的大鼠皮層神經(jīng)元與GelMA（一種凝膠材料）混合后逐層打印，構(gòu)建了3D neuMatrix。結(jié)果表明3D neuMatrix中的神經(jīng)細(xì)胞存活率高，并且隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，逐漸形成了類似大腦的3D神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，還能用于疾病建模、藥物篩選等。

圖 1. 3D neuMatrix的構(gòu)建示意圖

利用免疫熒光染色和3D重建技術(shù)，研究了3D neuMatrix中神經(jīng)細(xì)胞的類型和連接情況。結(jié)果顯示3D neuMatrix中主要是成熟的神經(jīng)元，還有少量星形膠質(zhì)細(xì)胞，這些神經(jīng)細(xì)胞形成了局部和長(zhǎng)距離的纖維連接，構(gòu)成了復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。

圖 2. 3D neuMatrix內(nèi)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)

采用鈣信號(hào)成像技術(shù)，觀察3D neuMatrix中神經(jīng)細(xì)胞的功能活動(dòng)及對(duì)藥物的反應(yīng)。結(jié)果表明3D neuMatrix中的神經(jīng)細(xì)胞存在自發(fā)的鈣振蕩，并且不同神經(jīng)集群之間有同步的信號(hào)傳遞，使用不同的神經(jīng)遞質(zhì)受體拮抗劑能調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的放電頻率和同步性。

圖3. 3D neuMatrix的功能連接和藥物反應(yīng)

通過(guò)RNA測(cè)序技術(shù)，比較了3D neuMatrix、2D培養(yǎng)神經(jīng)元和E18大鼠皮層的基因表達(dá)譜。結(jié)果顯示3D neuMatrix的轉(zhuǎn)錄組更接近E18大鼠皮層，在細(xì)胞間相互作用、細(xì)胞外基質(zhì)組織等通路的表達(dá)上與體內(nèi)組織更為相似，說(shuō)明其在分子水平上具有較高的生物 fidelity。

圖 4. 3D neuMatrix的轉(zhuǎn)錄組分析

運(yùn)用單細(xì)胞核RNA測(cè)序技術(shù)，分析了3D neuMatrix在培養(yǎng)第1天和第7天的細(xì)胞組成和分化情況。結(jié)果表明3D neuMatrix重現(xiàn)了大腦皮層的多種細(xì)胞類型，包括興奮性神經(jīng)元、抑制性神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞等，并且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞逐漸分化成熟，神經(jīng)功能相關(guān)的基因表達(dá)增加。

圖 5. 3D neuMatrix的單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果

通過(guò)氧葡萄糖剝奪/復(fù)氧（OGD/R）處理，在3D neuMatrix和2D培養(yǎng)神經(jīng)元中建立缺血性中風(fēng)模型，并與大鼠大腦中動(dòng)脈 occlusion/reperfusion（MCAO/R）模型的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較。結(jié)果顯示3D neuMatrix在OGD/R處理后，細(xì)胞活力下降，神經(jīng)功能受損，其轉(zhuǎn)錄組特征更接近大鼠MCAO/R模型，能更好地模擬缺血性中風(fēng)的病理生理過(guò)程。

圖 6. 3D neuMatrix用于缺血性中風(fēng)建模

研究結(jié)論
本研究成功構(gòu)建了名為3D neuMatrix的體外神經(jīng)組織，借助3D生物打印技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞組件和神經(jīng)回路的精準(zhǔn)調(diào)控以及空間組織的可調(diào)節(jié)性。單細(xì)胞分析顯示，在體外培養(yǎng)過(guò)程中，神經(jīng)元亞型和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞得以分化，神經(jīng)通訊相關(guān)基因的表達(dá)水平有所提升。通過(guò)疾病建模進(jìn)一步證實(shí)，3D neuMatrix在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制研究和治療性研究方面具有構(gòu)建更貼近生理真實(shí)模型的潛力。

文章來(lái)源：
https://doi.org/10.1002/advs.202504455