山二醫(yī)/上海交大周廣東團(tuán)隊(duì)：生物3D打印助力半月板重建

來(lái)源：EFL生物3D打印與生物制造

半月板是半月形纖維軟骨組織結(jié)構(gòu)，具有減震和穩(wěn)定膝關(guān)節(jié)生理功能。臨床上半月板損傷常見(jiàn)于運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)，嚴(yán)重者需進(jìn)行同種異體移植或假體移植半月板重建手術(shù)。當(dāng)前，基于“鋼筋-混凝土”理念的生物3D打印策略可以提供理想的組織工程半月板移植物，有望實(shí)現(xiàn)半月板置換再生修復(fù)。但是，臨床上半月板切除術(shù)中，韌帶斷裂、關(guān)節(jié)磨損加劇等引發(fā)炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激的惡劣微環(huán)境，嚴(yán)重阻礙半月板軟骨再生。因此，急需創(chuàng)新組織工程構(gòu)建策略，以協(xié)同調(diào)控軟骨免疫微環(huán)境，才能更好地實(shí)現(xiàn)半月板軟骨再生。

近期，山東第二醫(yī)科大學(xué)整形外科研究所、山東省組織再生修復(fù)與重建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（籌）王迪副教授，聯(lián)合上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院周廣東教授、華宇杰副研究員在《ACS Nano》期刊上發(fā)表論文“Core-Shell Codelivery Nanocarrier Synergistically Regulates Cartilaginous Immune Microenvironment for Total Meniscus Replacement”，本研究開(kāi)發(fā)了一種 "核-殼 "式共遞送納米給藥體系，可協(xié)同調(diào)控軟骨免疫微環(huán)境，成功應(yīng)用于全半月板置換術(shù)。如圖1所示，介孔二氧化硅納米顆粒內(nèi)核封裝一種抗氧化和抗炎中藥單體藥物——大黃素，同時(shí)在外殼上通過(guò)可逆二硫鍵修飾一種纖維軟骨分化因子GDF，成功構(gòu)建共遞送納米給藥體系（Em@MSN-GDF）。隨后，基于“鋼筋-混凝土”理念的生物3D打印構(gòu)建力學(xué)增強(qiáng)型半月板替代物，成功實(shí)現(xiàn)兔模型纖維軟骨再生與半月板重建。

圖1. 新型 "核-殼 "共遞送納米給藥體系（Em@MSN-GDF）協(xié)同調(diào)控軟骨免疫微環(huán)境用于全半月板置換的示意圖。

1.Em@MSN-GDF 制備和表征
本研究開(kāi)發(fā)了一種“核-殼”式共遞送納米載體Em@MSN-GDF，持續(xù)釋放大黃素和GDF，以調(diào)控半月板切除術(shù)后氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)等惡劣微環(huán)境，并促進(jìn)纖維軟骨再生。如圖2所示，大黃素封裝于介孔二氧化硅微球內(nèi)核；GDF通過(guò)二硫鍵可逆接枝于外殼。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，介孔硅球形形態(tài)均勻，直徑約170 nm；核磁共振和XPS光譜驗(yàn)證了介孔硅接枝改性和藥物負(fù)載的可行性。納米載體顯示出~14%的大黃素包封率和12.5%的GDF接枝率。45天持續(xù)釋放實(shí)驗(yàn)表明，大黃素釋放了約60%；GDF釋放了約50%，證明該系統(tǒng)具有長(zhǎng)期免疫調(diào)節(jié)和促進(jìn)纖維軟骨再生的潛力。

圖2. Em@MSN-GDF 納米載體制備和表征

2.Em@MSN-GDF/GC水凝膠表征
隨后，研究者將Em@MSN-GDF納米顆粒引入GelMA/CSMA（GC）軟骨特異性基質(zhì)水凝膠，構(gòu)建Em@MSN-GDF/GC復(fù)合水凝膠材料。如圖3所示，水凝膠能夠快速光交聯(lián)成形，具有良好的穩(wěn)定性、微孔結(jié)構(gòu)和機(jī)械性能，納米顆粒的加入未顯著影響其理化特性。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，水凝膠對(duì)成纖維細(xì)胞與軟骨細(xì)胞具有良好的生物相容性，并促進(jìn)細(xì)胞鋪展和增殖。

圖 3. GC 和 Em@MSN-GDF/GC 水凝膠的制備和理化特性表征。

3.體外抗氧化和抗炎功能評(píng)價(jià)

為了改善軟骨免疫微環(huán)境，本研究將具有抗氧化與抗炎作用的大黃素封裝于介孔二氧化硅納米顆粒中（Em@MSN-GDF）。H₂O₂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)顯示，Em@MSN和Em@MSN-GDF可顯著降低細(xì)胞活性氧ROS水平，并下調(diào)GPX1與NQO1表達(dá)，證明其抗氧化效果。LPS誘導(dǎo)下，兩組處理均促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2表型極化，抑制促炎癥因子TNF-α表達(dá)，促進(jìn)抗炎因子IL-4表達(dá)（圖 4）。研究結(jié)果表明，Em@MSN與Em@MSN-GDF可通過(guò)釋放大黃素發(fā)揮抗氧化抗炎作用，改善術(shù)后炎癥微環(huán)境，有助于半月板軟骨再生。

圖 4. Em@MSN和 Em@MSN-GDF 的體外抗氧化和抗炎作用

4.纖維軟骨分化功能評(píng)價(jià)
本研究采用體外Transwell模型研究發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞（CHs）分泌物可促進(jìn)纖維細(xì)胞（FBs）成軟骨分化。進(jìn)一步研究表明，GDF能夠顯著提升纖維細(xì)胞中軟骨相關(guān)基因（COL II、ACAN、α-SMA、SOX9）表達(dá)，并促進(jìn)其向纖維軟骨分化。進(jìn)一步通過(guò)不同F(xiàn)Bs/CHs比例的皮下植入實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)Bs7/CHs3組的軟骨再生效果最佳，其與FBs3/CHs7組在COL II表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但α-SMA表達(dá)更高，顯示出更優(yōu)的纖維軟骨表型特征（圖5）。

圖 5. GDF 對(duì)體外和體內(nèi)纖維軟骨再生功能評(píng)價(jià)

5.評(píng)估 Em@MSN-GDF 在體內(nèi)軟骨再生中的作用
為了提高軟骨再生穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度，研究者利用生物3D打印技術(shù)打印出矩形 PCL 支架，并注入了含有 FBs7/CHs3 細(xì)胞的GC水凝膠，分為GC-PCL組、Em@MSN/GC-PCL組和Em@MSN-GDF/GC-PCL組。如圖6所示，Em@MSN-GDF/GC-PCL表現(xiàn)出更高的楊氏模量和壓縮應(yīng)變，COL II和α-SMA表達(dá)水平也顯著提高，說(shuō)明GDF的持續(xù)釋放有效增強(qiáng)軟骨樣組織形成，同時(shí)Em@MSN-GDF/GC-PC組顯示出更好的機(jī)械性能、細(xì)胞相容性和軟骨誘導(dǎo)功能。

圖 6. Em@MSN-GDF/GC-PCL 體內(nèi)軟骨再生評(píng)價(jià)

6.半月板置換和修復(fù)效果評(píng)估
為驗(yàn)證半月板再生的可行性，本研究在新西蘭兔中進(jìn)行半月板切除和置換術(shù)，利用3D生物打印技術(shù)構(gòu)建含PCL支架、7:3比例FBs/CHs和Em@MSN-GDF/GC水凝膠的復(fù)合結(jié)構(gòu)，并植入缺損區(qū)域。術(shù)后6、12周MRI顯示組織重建良好。組織學(xué)表明Em@MSN-GDF/GC-PCL組在形態(tài)、細(xì)胞表型及基質(zhì)沉積方面更接近正常半月板。免疫熒光檢測(cè)顯示α-SMA、VEGF和VWF表達(dá)顯著升高，血管分布亦更符合生理特征。且ICRS評(píng)分顯示軟骨損傷明顯改善。結(jié)果表明，該系統(tǒng)可顯著促進(jìn)半月板再生，有望成為一種臨床可替代的半月板重建治療方案（圖 7）。

圖 7. 半月板置換和修復(fù)的體內(nèi)評(píng)估

本論文是由山東第二醫(yī)科大學(xué)與上海市第九人民醫(yī)院聯(lián)合培養(yǎng)研究生王雅杰完成。此外，該工作還得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2024YFA1107800）、國(guó)家自然科學(xué)基金、中國(guó)博士后科學(xué)基金等項(xiàng)目，以及上海市組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室平臺(tái)支持。

文章來(lái)源：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.4c16158.