實現(xiàn)快速功能補償與機械穩(wěn)定以治療急性肝衰竭

來源：EFL生物3D打印與生物制造

肝臟作為重要代謝器官，細胞密度高且結(jié)構(gòu)復(fù)雜。在肝臟組織工程領(lǐng)域，肝移植供體稀缺，利用細胞封裝水凝膠治療急性疾病成為研究熱點。構(gòu)建含高細胞密度且具備有效血管網(wǎng)絡(luò)的組織至關(guān)重要，這能實現(xiàn)快速功能補償，滿足代謝需求。

然而，當前面臨諸多難題。傳統(tǒng)用于封裝高密度細胞的水凝膠機械性能不足，難以承受生理血流剪切力，導致植入失�。欢鄶�(shù)研究依賴宿主血管自然生長或吻合，速度慢，無法防止大規(guī)模合成組織缺血性細胞死亡；實現(xiàn)生理相關(guān)細胞密度困難，現(xiàn)有3D打印研究的細胞密度遠低于天然組織，且高細胞密度會影響生物墨水的可打印性和細胞活力。  

為解決這些痛點，來自中國科學院動物研究所的顧奇教授團隊開發(fā)了一種微凝膠 - 水凝膠雜化材料（GMMHM），通過優(yōu)化微凝膠與生物大分子比例，形成的共價交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)具備良好機械完整性，可進行直接血管吻合。該雜化材料支持多種功能，如嵌入式3D打印構(gòu)建宏觀血管網(wǎng)絡(luò)、促進內(nèi)皮細胞自組裝形成微血管網(wǎng)絡(luò)等。研究成果以“A Microgel–Hydrogel Hybrid for Functional Compensation and Mechanical Stability in 3D Printed Cell-Dense Vascularized Liver Tissue”為題發(fā)表在《Advanced Materials》上。

研究內(nèi)容
1. 設(shè)計微凝膠-水凝膠雜化材料，通過制備不同成分比例的水凝膠并進行表征測試的研究方法，研究微凝膠-水凝膠雜化材料（GMMHM）的設(shè)計與特性。結(jié)果顯示，該雜化材料具備獨特的交聯(lián)結(jié)構(gòu)和孔隙特征，其彈性模量、韌性等機械性能可通過調(diào)整HA-MA和GMM濃度優(yōu)化，能平衡生物相容性和機械性能。

圖1. 3D打印微凝膠-水凝膠雜化材料構(gòu)建可植入血管化肝組織示意圖。  

2. 水凝膠雜化材料的設(shè)計策略及異質(zhì)特性，運用調(diào)整UV和37°C處理順序制備不同水凝膠、使用納米壓痕系統(tǒng)和流變儀測試力學性能、借助冷凍掃描電鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)等研究方法，探究不同成分對水凝膠力學性能和微觀結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，HA-MA和GMM濃度顯著影響水凝膠的有效楊氏模量等力學性能，GMMHM形成了內(nèi)部致密、外部松散的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，其孔隙結(jié)構(gòu)與力學性能密切相關(guān)。

圖2. 水凝膠雜化材料的設(shè)計策略及異質(zhì)特性。  

3. 嵌入式打印構(gòu)建宏觀血管并進行直接血管吻合，利用振蕩剪切流變儀測試材料流變特性、進行嵌入式3D打印實驗及動物血管吻合手術(shù)的研究方法，研究GMMHM用于構(gòu)建宏觀血管網(wǎng)絡(luò)及與宿主血管直接吻合的可行性。結(jié)果表明，GMMHM具有良好的剪切變稀和自愈合特性，可成功打印復(fù)雜血管結(jié)構(gòu)并實現(xiàn)與大鼠頸動脈和頸靜脈的直接血管吻合，保證植入后組織穩(wěn)定。

圖3. 嵌入式打印構(gòu)建工程化宏觀血管及直接血管吻合。  

4. 3D打印結(jié)構(gòu)中的初步血管生成和血管發(fā)生，采用細胞培養(yǎng)、免疫熒光染色、掃描電鏡觀察和定量分析等研究方法，研究GMMHM對內(nèi)皮細胞自組裝形成微血管網(wǎng)絡(luò)的影響。結(jié)果表明，GMMHM能促進血管生成和血管發(fā)生，形成復(fù)雜的微血管網(wǎng)絡(luò)，且該過程依賴于基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）對水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的降解。

圖4. 基于GMMHM水凝膠雜化材料的血管生成和血管發(fā)生。  

5. 支持間充質(zhì)干細胞和實質(zhì)細胞活性，通過將不同細胞類型封裝在GMMHM和GMMHM−中培養(yǎng)并檢測細胞活性、代謝功能等研究方法，研究GMMHM對多種細胞活性和功能的支持作用。結(jié)果表明，GMMHM具有良好的生物相容性，可促進間充質(zhì)干細胞（MSCs）、人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）等細胞的生長和擴展，支持原代人肝細胞（PHHs）和胚胎干細胞分化的心肌細胞的功能。

圖5. GMMHM雜化材料的生物相容性。  

6. 優(yōu)化3D空間構(gòu)建高細胞密度組織模型，運用分析不同細胞密度對水凝膠機械性能影響、調(diào)整水凝膠成分構(gòu)建組織模型等研究方法，研究如何優(yōu)化水凝膠以構(gòu)建高細胞密度（HCD）組織模型。結(jié)果表明，通過調(diào)整GMMHM中微凝膠和生物大分子比例，可實現(xiàn)高細胞密度且保證水凝膠具有適宜機械性能和生物相容性。

圖6. 異質(zhì)雜化材料構(gòu)建具有高細胞密度的可植入肝組織。  

7. 細胞密集型水凝膠雜化材料促進肝功能，通過免疫染色、定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）檢測肝相關(guān)蛋白和基因表達等研究方法，研究HCD的肝細胞在GMMHM中培養(yǎng)后的肝功能。結(jié)果表明，高細胞密度能增強肝組織功能相關(guān)蛋白和基因的表達，且添加黃原膠（XG）可改善GMMHM構(gòu)建宏觀血管的生物打印性能。

圖7. 不同細胞密度的工程化肝組織的肝功能。  

8. 工程化血管化肝臟對SD大鼠的快速功能支持，借助建立大鼠肝衰竭模型、植入工程化肝組織并進行血液生化分析等研究方法，研究工程化血管化肝組織對急性肝衰竭SD大鼠的治療效果。結(jié)果表明，植入含高細胞密度肝細胞的工程化肝組織可延長大鼠存活時間，改善肝功能指標，降低血清氨水平。

圖8. 體內(nèi)快速功能支持。

研究結(jié)論
本研究開發(fā)了一種具有異質(zhì)微環(huán)境的微凝膠-水凝膠雜化材料，它利用化學交聯(lián)和物理纏結(jié)來調(diào)控基質(zhì)剛度和孔隙結(jié)構(gòu)。該雜化材料不僅能在體外支持多種細胞的形態(tài)發(fā)生和功能活動，還具備工程組織所需的機械性能，可實現(xiàn)直接血管吻合，促進體內(nèi)快速功能補償。通過將血管生成、血管發(fā)生與嵌入式3D打印相結(jié)合，在厚組織內(nèi)構(gòu)建了復(fù)雜的微血管網(wǎng)絡(luò)和宏觀血管通道。增強的機械性能使雜化材料能與宿主血管直接吻合，減少連接時間，降低厚組織壞死風險。通過調(diào)整微凝膠與生物大分子的比例，本研究在體外構(gòu)建了高細胞密度的高度血管化肝組織模型，并成功植入急性肝衰竭的SD大鼠體內(nèi)，實現(xiàn)了快速血液灌注和肝功能恢復(fù)，為構(gòu)建具有獨特理化性質(zhì)的血管化組織提供了新方法。

文章來源：
https://doi.org/10.1002/adma.202413940