3D打印骨修復(fù)研究：分級組裝支架中實現(xiàn)羥基磷灰石的可控釋放

來源：EFL生物3D打印與生物制造

在骨修復(fù)領(lǐng)域，當前面臨著重大挑戰(zhàn)。骨具有復(fù)雜的層次結(jié)構(gòu)和多孔網(wǎng)絡(luò)，其再生過程呈現(xiàn)出時間和空間的復(fù)雜性，涉及多個階段及同步的生物過程。然而，大多數(shù)骨修復(fù)材料僅注重空間結(jié)構(gòu)設(shè)計，忽略了骨發(fā)育過程中的時間復(fù)雜性，無法有效響應(yīng)甚至阻礙骨愈合，導(dǎo)致骨再生質(zhì)量不佳。同時，羥基磷灰石（HAp）在骨再生中雖至關(guān)重要，但其結(jié)構(gòu)和空間分布的調(diào)控一直是難題，不同結(jié)晶度和形態(tài)的 HAp 對骨愈合影響各異 。

為解決這些痛點，來自四川大學(xué)的樊渝江、孫勇教授團隊開展了相關(guān)研究。他們結(jié)合 3D 打印技術(shù)與超臨界 CO₂ foaming 技術(shù)，通過有機 - 無機整合和表面成核生長的方式，將結(jié)構(gòu)化的 HAp 集成到分級組裝支架中。利用可控沉積和分級組裝技術(shù)，調(diào)控微納結(jié)構(gòu)化 HAp 的空間分布和釋放時間，使其與骨愈合過程相匹配。相關(guān)工作以 “Spatially programmed hydroxyapatite in hierarchically assembled scaffold self - adapts osteogenic progression” 為題發(fā)表在《Chemical Engineering Journal》上，為骨修復(fù)材料的設(shè)計提供了新方向，有望實現(xiàn)高質(zhì)量的骨再生。

研究內(nèi)容
1. 裝飾有空間編程羥基磷灰石的分級組裝支架自適應(yīng)成骨進程
通過構(gòu)建分級組裝支架并調(diào)控其中球形 HAp（sHAp）和納米花狀 HAp（fHAp）空間分布與釋放時間的研究方法，研究了支架對免疫微環(huán)境的改善作用、為骨基質(zhì)成熟提供鈣 / 磷來源的能力以及與整個骨再生周期的匹配情況。結(jié)果表明，調(diào)控 sHAp/fHAp 的空間分布和釋放時間，能有效改善免疫微環(huán)境，提供滿足骨基質(zhì)成熟所需的鈣 / 磷，使支架自適應(yīng)骨再生的各個階段，實現(xiàn)從促進早期免疫調(diào)節(jié)到為骨組織生長持續(xù)提供營養(yǎng)物質(zhì)的功能，最終達成與骨再生周期的良好匹配，促進高質(zhì)量骨再生。

圖 1. 裝飾有空間編程羥基磷灰石的分級組裝支架自適應(yīng)成骨進程示意圖

2. 納米花狀 fHAp 的制備與表征
通過在 PLGA 或 HC 薄膜表面利用模擬體液（SBF）溶液進行可控沉積的方法制備納米花狀 fHAp，運用掃描電子顯微鏡（SEM）、透射電子顯微鏡（TEM）觀察其微觀形貌，使用 X 射線衍射（XRD）分析相組成和結(jié)晶度，采用接觸角測量儀測定表面親水性，利用 TG/DSC 測試樣品的相轉(zhuǎn)變溫度和無機成分含量，借助 X 射線光電子能譜（XPS）檢測 HC 水凝膠中螯合的鈣離子，用鈣比色測定試劑盒量化鈣離子釋放。研究了 fHAp 的微觀結(jié)構(gòu)、結(jié)晶度、親水性、鈣離子釋放等特性。結(jié)果表明，fHAp 呈花狀，有 50 - 300nm 的多孔結(jié)構(gòu)，結(jié)晶度為 31.24%（相對于 sHAp），親水性較好，且能更快釋放鈣離子。

圖 2. 納米花狀 fHAp 的制備與表征。

3.納米花狀 fHAp 調(diào)節(jié)巨噬細胞 M2 極化
將炎癥刺激的巨噬細胞與負載 fHAp 和 sHAp 的薄膜共培養(yǎng)，運用 SEM 觀察細胞形態(tài)，通過細胞骨架染色輔助分析，利用流式細胞術(shù)檢測巨噬細胞表型，采用 ELISA 試劑盒測定炎癥相關(guān)蛋白和因子的表達。研究 fHAp 對巨噬細胞極化行為的影響。結(jié)果顯示，fHAp 組巨噬細胞呈典型 M2 形態(tài)，M2 巨噬細胞數(shù)量顯著增加，M1 巨噬細胞數(shù)量減少，同時抗炎因子 TGF-β1 和 IL-10 表達升高，促炎因子 TNF-α 和 IL-1β 表達降低，證明 fHAp 可促進巨噬細胞向 M2 極化。

圖 3. 納米花狀 fHAp 調(diào)節(jié)巨噬細胞 M2 極化。

4. 納米花狀 fHAp 的生物學(xué)功能
通過水接觸角測試、激光共聚焦顯微鏡觀察、Transwell 實驗、細胞增殖實驗、透射電鏡觀察和免疫熒光染色等方法，研究 fHAp 在蛋白質(zhì)吸附、干細胞遷移與招募、細胞增殖與鋪展以及膠原礦化方面的能力。結(jié)果表明，負載 fHAp 的薄膜接觸角更小，蛋白質(zhì)吸附更均勻且強度更高，能更好地促進干細胞遷移和招募，對細胞增殖和鋪展的促進作用也更明顯，同時可有效促進膠原纖維礦化，使礦化后的膠原纖維在 TEM 下對比度更高，免疫熒光染色也證實了這一點。

圖 4. 納米花狀 fHAp 的生物學(xué)功能。

5. 分級組裝支架的構(gòu)建及免疫調(diào)節(jié)作用
以 3DP PLGA/sHAp 支架為基礎(chǔ)，負載纖維凝膠螯合的 sHAp 并在表面整合 fHAp 構(gòu)建分級組裝支架，運用 COMSOL Multiphysics 軟件進行離子擴散模擬，使用 SEM 和激光共聚焦顯微鏡觀察 HAp 分布，通過細胞與支架共培養(yǎng)實驗、免疫熒光染色和流式細胞術(shù)檢測細胞行為和巨噬細胞極化情況，采用 ELISA 測定炎癥因子表達。研究支架的構(gòu)建、HAp 的空間分布與釋放行為以及免疫調(diào)節(jié)功能。結(jié)果顯示，支架中不同位置的 HAp 擴散速率不同，且 MHCP 支架能促進細胞黏附、增殖和鋪展，誘導(dǎo)巨噬細胞向 M2 極化，降低促炎因子表達，增加抗炎因子表達，具有良好的免疫調(diào)節(jié)能力。

圖 5. 分級組裝支架的構(gòu)建及免疫調(diào)節(jié)作用。

6.成骨分化和膠原礦化
將骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）接種在分級組裝支架上培養(yǎng)，采用堿性磷酸酶（ALP）和茜素紅（ARS）染色觀察細胞成骨分化和礦化結(jié)節(jié)形成情況，通過實時定量逆轉(zhuǎn)錄 PCR（qRT-PCR）分析成骨和血管生成相關(guān)基因的表達，利用 Micro-CT 分析裸鼠皮下異位成骨情況，結(jié)合組織學(xué)染色和免疫組化染色觀察新骨形成和膠原纖維礦化。研究分級組裝支架對 BMSCs 成骨分化和膠原礦化的影響。結(jié)果表明，MHCP 組的 ALP 和 ARS 染色更明顯，相關(guān)基因表達上調(diào)，裸鼠皮下新骨形成更多，膠原纖維礦化更顯著，證明該支架能有效促進成骨分化和膠原礦化。

圖 6. 成骨分化和膠原礦化。

7.分級組裝支架修復(fù)臨界尺寸顱骨缺損
構(gòu)建兔顱骨缺損模型并植入不同支架，通過推出試驗評估支架與周圍骨組織的整合能力，利用 Micro-CT 和 X 射線成像系統(tǒng)分析新骨形成情況，采用 RNA 測序研究分子機制，結(jié)合免疫熒光染色觀察相關(guān)蛋白表達。研究分級組裝支架修復(fù)顱骨缺損的效果及機制。結(jié)果顯示，MHCP 支架的推出力更高，新骨體積分數(shù)更大，能更好地促進骨再生，其通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、促進細胞黏附和陽離子運輸?shù)葯C制實現(xiàn)高效骨修復(fù)。

圖 7. 分級組裝支架修復(fù)臨界尺寸顱骨缺損。

8.分級組裝支架自適應(yīng)骨再生過程
對植入分級組裝支架的兔顱骨缺損在不同時間點取材，通過組織學(xué)染色（H&E、Masson、ARS）和免疫熒光染色（CD44、Runx2、CD31、OPN 等）觀察骨再生各階段的細胞行為、組織變化和分子調(diào)控。研究分級組裝支架在骨再生不同階段的作用。結(jié)果表明，在骨再生早期，fHAp 促進巨噬細胞極化和干細胞招募；中期，支架引導(dǎo)組織長入和早期成骨、血管生成；后期，支架完成使命，骨基質(zhì)重塑為致密新骨組織，實現(xiàn)了高質(zhì)量的骨再生。

圖 8. 分級組裝支架自適應(yīng)骨再生過程。

研究結(jié)論
本研究結(jié)合3D打印技術(shù)與超臨界CO₂發(fā)泡技術(shù)，通過有機-無機整合和表面成核生長的方式，構(gòu)建了具有全再生周期調(diào)節(jié)能力的時空分級組裝支架。該支架將納米花狀fHAp作為骨愈合早期微環(huán)境的調(diào)節(jié)開關(guān)，結(jié)合支架中結(jié)構(gòu)化HAp的時空釋放，增強了骨重塑過程，最終實現(xiàn)了臨界尺寸骨缺損的再生。這一成果為可降解骨修復(fù)材料的結(jié)構(gòu)和功能設(shè)計提供了新的研究思路，有望推動骨修復(fù)領(lǐng)域的發(fā)展，為臨床治療骨缺損相關(guān)疾病提供更有效的解決方案。

文章來源：https://doi.org/10.1016/j.cej.2025.162437