清華大學孫偉團隊3D打印出可進行刺激性反應的神經回路

2020年6月23日，南極熊獲悉，清華大學孫偉教授團隊3D打印出了能夠培育神經細胞的大腦類組織結構。他們從大鼠的皮層中提取了一組初級神經細胞，并將其整合到打印的結構中，然后測試了所制造的結構。有趣的是，經過數(shù)周的體外培育，初級神經細胞已經形成了一個復雜的神經回路，能夠對外界刺激做出反應。

這項研究結果已經發(fā)表在論文 "Engineering of brain-like tissue constructs via 3D Cell-printing technology "中。該論文由Yu Song, Xiaolei Su, Kevin F. Firouzian, Yongcong Fang, Ting Zhang, and Wei Sun共同撰寫。

△提取神經細胞進行生物打印，圖片來自清華大學。

一個活的3D模型

3D生物打印技術雖然先進，但還不能制造有用的完整器官。幸運的是，較小和不太復雜的組織結構在健康監(jiān)測和藥物測試方面有其用途。例如，醫(yī)學專業(yè)人員能夠從個人身上收集神經細胞，并將其在3D打印的網格狀結構上生長成較大的培養(yǎng)物。這些3D結構很好地模仿了真實腦組織中的通路，因此神經細胞把它們當成了真實腦組織，并在適當?shù)臓I養(yǎng)下，沿著它們生長。

由此產生的神經回路的行為就像一個微型大腦一樣。一旦復雜到足以對刺激做出反應，就將培養(yǎng)物暴露在實驗藥物中，并記錄它們的神經反應，讓我們了解如果人類試用藥物，實際的大腦可能會做出怎樣的反應。

△3D打印的類腦組織，照片來自清華大學

生物打印大腦

研究人員必須經過幾個階段的試錯，才能得到正確的結構。他們發(fā)現(xiàn)最佳的噴嘴直徑和打印速率分別為0.51毫米和5μL/s。所得結構的彈性模量約為6千帕，并采用免疫染色成像技術跟蹤打印結構上神經細胞的生長情況。

為了測試神經網絡的電刺激反應，該團隊直接在4×4電極陣列中培養(yǎng)它們。產生電場并觀察神經元，顯示出敏感的活動。然后用河豚毒素來測試培養(yǎng)物的藥物敏感性，表明3D打印結構 "作為藥物測試模型的潛力巨大"。

最后，研究了2D和3D結構打印時神經細胞的存活率。3D結構可以保持整整4周的活力，最初85%的細胞在生物打印過程中存活下來。相比之下，2D結構的存活率只有25%，驗證了清華科學家3D生物打印腦組織方法的優(yōu)越性。

△用電極陣列測試2D和3D形態(tài)，圖片來自清華大學

孫偉教授及其近期生物3D打印科研成果


生物3D打印作為生物制造的核心技術，其運用細胞、蛋白質、生物材料等作為構造單元，以構建生物學模型、生命系統(tǒng)和治療產品。孫偉從構造單元層面上提出了生物3D打印的五個階段：

第一個階段是無生物相容性材料的打印，如樹脂、塑料等，主要用于外科手術設計模型或是牙科手術規(guī)劃；

第二個階段是打印具有生物相容性但不能降解的材料，如金屬，主要用于不可降解的假肢移植物；

第三個階段是打印具有生物相容性可降解的材料，如可降解的高分子材料，例如骨組織工程支架、人造皮膚修復體以及心臟支架等；

第四個階段是打印活性細胞，這類材料可以用來構建體外生物學模型、藥理/病理模型、器官芯片等；

第五個階段是打印類器官，如人工的生命系統(tǒng)、微型生理系統(tǒng)、細胞機器人等

生物3D打印的五個階段

今年4月份，清華大學深圳國際研究生院彌勝利與孫偉教授課題組在知名學術雜志Nature Communications發(fā)表題為Fiber reinforced GelMA hydrogel to induce the regeneration of corneal stroma的文章，利用生物3D打印技術，制備纖維水凝膠復合支架，在角膜基質的誘導再生領域取得重大進展。

如何制備能夠模擬天然角膜基質結構的支架，同時保持角膜基質細胞的表型，誘導角膜基質的再生，是一個重大的挑戰(zhàn)。

生物3D打印角膜支架
針對這一難題，清華大學彌勝利與孫偉教授課題組提出了使用近場靜電紡絲這一生物3D打印技術制備網格狀的亞微米纖維支架，后期通過水凝膠技術，制備了纖維水凝膠復合支架，用于模擬正交定向的角膜基質板層結構和板層之間起連接作用的糖蛋白。并提出了一種最優(yōu)的拓撲結構及化學因子的組合，可以抑制角膜基質細胞的成纖維分化，保持其表型，并最終實現(xiàn)角膜基質的誘導再生。

角膜支架的材料

目前近場靜電紡絲技術應用最廣泛的材料是PCL，但是由于PCL是疏水材料，不利于細胞的粘附。因此該研究利用PEG作為引發(fā)劑，合成了PEG和PCL的共聚物PECL，顯著的提高了PCL的親水性。并首次利用近場靜電紡絲技術成功的制備了正交定向的PECL亞微米纖維支架，角膜緣基質干細胞可以在支架表面黏附并沿著纖維方向鋪展及生長。

研究通過將MA修飾到明膠大分子鏈上合成了GelMA，探究出最優(yōu)的MA修飾度及GelMA濃度可以使封裝在GelMA水凝膠內的角膜緣基質干細胞保持高的細胞活性并能鋪展開。制備模具并通過灌注的方式制備了纖維水凝膠復合支架。

纖維水凝膠復合支架（圖標e）

角膜支架的性能

通過研究不同纖維間距的網格狀支架對纖維水凝膠復合支架理化性能的影響，找出了最優(yōu)的拓撲結構可以使纖維水凝膠在力學性能、透光度和溶脹性方面最接近于天然的角膜組織。

研究將角膜緣基質干細胞接種在2D的細胞培養(yǎng)皿，3D的GelMA水凝膠和最優(yōu)選的纖維水凝膠復合支架內，并研究角膜緣基質干細胞在含血清及不含血清的培養(yǎng)基中的分化及角膜基質細胞表型的維持。研究表明這種最優(yōu)選的纖維水凝膠的拓撲結構及無血清培養(yǎng)基可以抑制角膜基質細胞向成纖維細胞分化。

最后研究使用大鼠進行角膜內的板層移植實驗，分別進行了有無化學因子的3D的GelMA水凝膠和有無化學因子的最優(yōu)選的纖維水凝膠支架的移植，對照組為自體角膜移植。術后通過OCT，免疫熒光染色及HE染色進行3個月的研究觀察，發(fā)現(xiàn)相比于其他的支架，含化學因子的最優(yōu)選的纖維水凝膠支架的移植可以最好的實現(xiàn)角膜基質的誘導再生。

今年5月，孫偉教授團隊通過3D打印制造出了一種個性化的宮頸組織植入物，可以對抗人類乳頭瘤病毒（HPV）。通過在錐形聚氨酯植入物的多孔結構中，加載一種抗HPV蛋白，該團隊能夠定量控制該蛋白的釋放，并在宮頸部位附近抑制HPV的生長。

3D打印的宮頸植入物，圖為清華大學的照片

HPV與宮頸癌

HPV是全球91%的宮頸癌病例的病因。每年有46萬個新病例，主要的治療方法是宮頸錐體切除術，即切除一個錐體形狀的組織樣本，用于診斷。如果有癌前細胞存在，該方法還可以去除癌前細胞，大部分組織會在六周內重新生長出來。然而，這種治療方法并不是神藥，因為它可能導致組織缺損，而且往往感染復發(fā)率較高。

3D打印的宮頸移植術

研究人員的目標是開發(fā)一種非破壞性的抗HPV植入物，這種植入物也可以促進結扎部位的組織生長。

首先是根據醫(yī)學影像數(shù)據設計出錐形結構，然后選擇的材料是FDA認證的可植入生物材料--聚氨酯，采用的3D打印技術是低溫沉積（LDM）。與普通的FDM不同，LDM是在零度以下的環(huán)境中進行的，通常是在-20°C到-30°C的環(huán)境中進行，所以相分離是在打印結構內部進行的。結合凍干技術，可以在3D打印出的零件中獲得多孔結構。

植入物的多孔結構，圖片來源：清華大學

多孔性在這里很重要，因為它可以讓研究人員在植入物中裝載抗HPV "JB蛋白"。為了修改和測試不同的孔隙度，研究人員在制造過程中簡單地修改了溫度曲線，并實現(xiàn)了各種導線間距。研究小組發(fā)現(xiàn)，孔隙度與蛋白質負載之間呈線性負相關，但蛋白質的釋放率隨孔隙度的增加而增加。研究人員發(fā)現(xiàn)，該蛋白能有效地抑制HPV進入宿主細胞，降低了HPV作為植入部位的活性。

細胞毒性和細胞相容性試驗也指出，植入物能促進細胞生長和粘附，修復愈合后的組織。在此基礎上，力學測試返回的力學性能與原始宮頸組織相當--抗壓模量為0.06-0.25兆帕。該結果有力地表明，3D打印技術可用于修復凝固后的宮頸組織，并抑制HPV感染的復發(fā)。

生物相容性試驗中的成像，圖片來源：清華大學

如果你想進一步了解生物3D打印技術的進展，3月，孫偉教授及生物3D打印領域一眾大咖們在知名期刊Biofabrication上發(fā)表文章生物3D打印路線圖（The Bioprinting Roadmap），從生物3D打印的各個層面提出目前現(xiàn)狀、存在的問題與未來的可能路徑。無論您想全面了解生物3D打印，還是試圖探索本領域的新方向，看這一篇就夠了。

IOP官方下載量已破5000，當之無愧開年最火生物3D打印綜述。

點我閱讀生物3D打印路線圖（The Bioprinting Roadmap）

編譯自：3dprintingindustry