《AFM》3D 打印 “腸” 奇跡：構(gòu)建三培養(yǎng)管狀網(wǎng)狀人工腸

來源：EFL生物3D打印與生物制造

先天性腸道閉鎖或狹窄等疾病常需手術(shù)干預(yù)，但對于胎兒或兒科患者，手術(shù)切除可能引發(fā)短腸綜合征，進(jìn)而需要器官移植。然而，胎兒供體短缺限制了器官的可獲取性，因此開發(fā)類器官再生療法和人工器官迫在眉睫。在人工腸道的研究中，盡管3D生物打印技術(shù)取得了一定進(jìn)展，但此前的研究多聚焦于腸道內(nèi)壁部分結(jié)構(gòu)的構(gòu)建或藥物吸收模型的開發(fā)，無法充分模擬天然腸道的完整結(jié)構(gòu)和功能。已有的方法在容納細(xì)胞類型、機(jī)械性能以及促進(jìn)細(xì)胞間相互作用等方面存在不足，難以滿足實際移植需求。  

來自韓國機(jī)械與材料研究所、忠南國立大學(xué)和韓國生物科學(xué)與生物技術(shù)研究所的Seok-jo Yang教授和Junhee Lee教授團(tuán)隊合作開展研究。他們利用混合3D打印技術(shù)，構(gòu)建了一種三培養(yǎng)管狀網(wǎng)狀腸道（TTMI），整合了肌成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞。該團(tuán)隊通過使用低濃度的明膠甲基丙烯酰（GelMA）生物墨水提高細(xì)胞活力，采用雙冷卻模塊改善打印性能，并運用多頭四軸生物打印機(jī)增強(qiáng)支架的機(jī)械性能。相關(guān)工作以“Hybrid 3D-Printed Tri-Cultured Intestine with Tubular Mesh Structure”為題發(fā)表在《Advanced Functional Materials》上，為人工腸道的發(fā)展提供了新的方向，有望推動組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)步。

研究內(nèi)容
1. 用于TTMI的多頭3D打印系統(tǒng)開發(fā)，通過構(gòu)建先天性腸道閉鎖或狹窄胎兒的人工腸移植模型，利用多頭四軸可控3D生物打印機(jī)及加熱、冷卻模塊進(jìn)行實驗，研究了TTMI的設(shè)計、構(gòu)建過程以及細(xì)胞在其中的分布和相互作用。結(jié)果表明，成功設(shè)計并制備出具有四層結(jié)構(gòu)、包含三種細(xì)胞類型的TTMI，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性良好，細(xì)胞間能有效相互作用，模擬了天然腸道的部分結(jié)構(gòu)和功能。

圖1. 用于TTMI的多頭3D打印系統(tǒng)開發(fā)。  

2. PCL管狀網(wǎng)的機(jī)械性能，使用萬能測試機(jī)和特定夾具對不同網(wǎng)格間距的PCL管狀網(wǎng)進(jìn)行拉伸測試，測量其應(yīng)力 - 應(yīng)變曲線、彈性恢復(fù)率等指標(biāo)。研究了PCL管狀網(wǎng)的拉伸強(qiáng)度、屈服強(qiáng)度、彈性模量以及彈性恢復(fù)率與網(wǎng)格間距的關(guān)系。結(jié)果顯示，隨著網(wǎng)格間距從0.6mm增加到2.0mm，拉伸強(qiáng)度、屈服強(qiáng)度和楊氏模量降低；網(wǎng)格間距為1.0mm和1.2mm時各項性能表現(xiàn)相似；彈性恢復(fù)率在網(wǎng)格間距為1.0mm時較好，綜合考慮選擇1.0mm網(wǎng)格間距制備管狀網(wǎng)。

圖2. PCL管狀網(wǎng)的機(jī)械性能。  

3. 使用雙冷卻模塊打印低濃度GelMA，運用旋轉(zhuǎn)流變儀測量GelMA的流變特性，通過COMSOL模擬和實際測量溫度，研究了不同濃度GelMA在不同溫度下的溶膠 - 凝膠轉(zhuǎn)變行為，以及雙冷卻模塊對低濃度GelMA打印的影響。結(jié)果表明，不同濃度GelMA的溶膠 - 凝膠轉(zhuǎn)變溫度不同，雙冷卻模塊能有效維持2%和3% GelMA的凝膠狀態(tài)，確保管狀生物打印的形狀保真度，并得出了不同濃度GelMA打印的最佳溫度和時間條件。

圖3. 使用雙冷卻模塊打印低濃度GelMA。  

4. 優(yōu)化GelMA濃度以提高打印性和細(xì)胞活力，將HUVECs和CCD - 18Co細(xì)胞分別封裝在不同濃度GelMA中進(jìn)行打印，利用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞活性和形態(tài)，通過CCK - 8實驗檢測細(xì)胞增殖情況。研究了不同濃度GelMA對兩種細(xì)胞的活力、增殖和分化的影響。結(jié)果顯示，2% GelMA有利于HUVECs的增殖和維持形態(tài)，3% GelMA對CCD - 18Co細(xì)胞的增殖和分化最為有利，因此分別選擇2%和3% GelMA用于封裝這兩種細(xì)胞。

圖4. 優(yōu)化GelMA濃度以提高HUVECs和CCD - 18Co細(xì)胞的打印性和活力。  

5. CCD - 18Co和Caco - 2細(xì)胞在TTMI中的相互作用，將Caco - 2細(xì)胞和CCD - 18Co細(xì)胞分別接種或共接種在3% GelMA打印的PCL管狀網(wǎng)上，運用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞存活和生長情況，通過CCK - 8實驗檢測細(xì)胞增殖，用堿性磷酸酶（ALP）和DNA檢測評估細(xì)胞分化，借助掃描電子顯微鏡（SEM）觀察微絨毛。研究了兩種細(xì)胞在TTMI中的相互作用對細(xì)胞增殖和分化的影響。結(jié)果表明，兩種細(xì)胞共培養(yǎng)促進(jìn)了Caco - 2細(xì)胞的增殖和分化，PCL管狀網(wǎng)有助于細(xì)胞間相互作用。

圖5. CCD - 18Co和Caco - 2細(xì)胞的相互作用促進(jìn)腸上皮生長。  

6. TTMI的生物學(xué)特性，對含有三種細(xì)胞的TTMI進(jìn)行細(xì)胞追蹤、組織學(xué)染色、免疫染色和跨內(nèi)皮電阻（TEER）測量等實驗，研究了TTMI中細(xì)胞的增殖、分化、定位以及上皮膜形成情況。結(jié)果表明，TTMI中三種細(xì)胞類型的排列與天然腸道相似，細(xì)胞增殖和分化良好，細(xì)胞間相互作用促進(jìn)了上皮膜的形成，證明TTMI可作為體外模型模擬腸道的部分功能。

圖6. TTMI的生物學(xué)特性。

研究結(jié)論
本研究構(gòu)建了一種模仿人類胎兒腸道結(jié)構(gòu)和細(xì)胞組成的三培養(yǎng)管狀網(wǎng)狀腸道（TTMI），這是人工腸道發(fā)展的重要進(jìn)展。研究將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）、人正常結(jié)腸成纖維細(xì)胞（CCD - 18Co）和人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞（Caco - 2）整合到人工腸道中，發(fā)現(xiàn)其可支持細(xì)胞增殖、分化并形成功能性腸屏障，證實了三培養(yǎng)技術(shù)在組織工程中開發(fā)可植入材料的適用性。通過結(jié)合多頭3D生物打印機(jī)與混合打印技術(shù)、旋轉(zhuǎn)接種板、四軸控制系統(tǒng)以及加熱和雙冷卻模塊，成功制備出TTMI。該模型細(xì)胞增殖和分化率高，細(xì)胞間相互作用促進(jìn)了上皮細(xì)胞分化和上皮膜形成。不過，TTMI模型仍需體內(nèi)驗證。此外，4D形狀記憶技術(shù)的發(fā)展可能有助于提升其植入后的機(jī)械強(qiáng)度和彈性恢復(fù)能力。TTMI為研究腸道生理、藥物吸收和疾病建模提供了有用平臺，在再生醫(yī)學(xué)和個性化移植治療方面具有潛在應(yīng)用價值。

文章來源：
https://doi.org/10.1002/adfm.202424495