《Biofabrication》：3D打印助力“魚鱗明膠”新應用可用作骨修復

來源：EngineeringForLife  

開發(fā)適用于生物制造和模擬細胞外基質(zhì)物理化學特性的生物材料墨水對于組織工程應用中的生物打印技術(shù)至關(guān)重要。使用動物來源的蛋白質(zhì)材料，如水母膠原蛋白或魚鱗(FS)明膠，已成為生物材料墨水設計的重要支柱，以提高水凝膠的生物活性。然而，除了提取蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)外，由于其有機（膠原蛋白）和無機（羥基磷灰石）含量，使用結(jié)構(gòu)完整的FS作為添加劑可以提高水凝膠的生物相容性和生物活性，同時提高3D打印應用中的機械強度。

為了檢驗這一假設，來自伊利諾伊理工學院的Funda Tihminlioglu聯(lián)合埃爾朗根-紐倫堡大學的Aldo R Boccaccini團隊展示了一種由FS和藻酸鹽二醛明膠(ADA-GEL)組成的復合生物材料墨水，用于3D生物打印應用（圖1）。由于水凝膠顯著增加的剛度和支持的骨誘導性，作為天然膠原蛋白和羥基磷灰石來源的FS結(jié)構(gòu)有助于骨工程應用的生物材料墨水特性。FS微粒是膠原蛋白和羥基磷灰石的天然來源（圖 1B），用作生物相容性添加劑，ADA-GEL 用作水凝膠基質(zhì)（圖1C）。

相關(guān)研究成果以“Fish scale containing alginate dialdehyde-gelatin bioink for bone tissue engineering”為題于2023年1月27日發(fā)表在《Biofabrication》上。

圖1 含有前成骨細胞 MC3T3-E1 細胞的 ADA-GEL/FS 生物墨水示意圖

1. 3D打印的ADA-GEL/FS水凝膠
含有1%、3%、5% 和 10%（重量百分比）FS 顆粒的 3D 生物打印 ADA-GEL/FS 水凝膠很容易制成具有10層的圓形。圖2A-C顯示了分別使用氯化鈣和mTG交聯(lián)后細絲形成、印刷ADA-GEL/FS結(jié)構(gòu)和印刷水凝膠結(jié)構(gòu)的優(yōu)化。印刷結(jié)構(gòu)的光學顯微鏡圖像表明所有組都具有形狀保真度和鏈之間的方形大孔。ADA-GEL/FS的可打印性根據(jù) Pr 因子、U 因子、孔徑和線直徑進行評估。（圖2D-F）。此外，制造的支架的孔徑隨著 FS 濃度的增加而減�。▓D2G）。

圖2 3D打印水凝膠復合支架

SEM顯示在ADA-GEL基質(zhì)中摻入FS顆粒會增加表面的粗糙度（圖3A）。通過增加顆粒濃度和摻入 ADAGEL 結(jié)構(gòu)來改變支架的表面形態(tài)FS 顆粒的膠原含量及其纖維結(jié)構(gòu)會影響表面形態(tài)，從而導致表面粗糙度增加。顆粒與 ADA-GEL 相互作用的區(qū)域和結(jié)構(gòu)中顆粒的纖維結(jié)構(gòu)如圖3B所示。明膠和膠原蛋白的相同化學成分使 ADA-GEL 和 FS 顆粒之間具有良好的相互作用，并具有適當?shù)慕缑嫦嗷プ饔谩?br />

圖3 3D打印FS增強型ADA-GEL支架

2. FS顆粒的添加提高了機械性能
通過應力松弛試驗研究了摻入FS的ADA-GEL水凝膠的機械性能。為機械測試準備的水凝膠的光學顯微鏡圖像如圖4A所示，測試結(jié)果表明ADA-GEL的剛度和楊氏模量最低，松弛速度最快。將FS摻入ADA-GEL基質(zhì)中可顯著提高剛度，從而提供復合結(jié)構(gòu)，SEM圖像證實了這一點（圖4B）。與其他組相比，在 10%FS摻入組中發(fā)現(xiàn)更高的壓應力。隨著顆粒濃度的增加，水凝膠的應力松弛得到顯著改善。水凝膠的楊氏模量根據(jù)顆粒濃度而增加，在ADAGEL/10%水凝膠中，較高的模量記錄為 96±8kPa，與其他組相比存在統(tǒng)計學差異（圖4D）。

圖4 復合水凝膠的機械性能

3. ADA-GEL/FS組合物增加生物活性
ADA-GEL/FS 支架的生物活性通過SEM、EDX和FTIR分析進行評估。通過在SBF中形成礦化CaP涂層的沉積。EDX分析證實了支架表面的CaP層形成，顯示了形成層表面的鈣 (Ca)、氧 (O) 和磷 (P) 元素（圖6B）；FTIR光譜表明復合支架表面形成了碳酸鹽和磷酸鹽。結(jié)合 SEM、EDX 和 FTIR 結(jié)果，可以證實ADA-GEL/FS 水凝膠具有生物活性，生物活性隨著 FS 顆粒的添加增加了CaP的形成。

圖5 ADA-GEL/FS復合支架的生物活性研究

4. 水凝膠的細胞培養(yǎng)
接著，作者進行體外細胞培養(yǎng)研究以研究MC3T3-E1前成骨細胞在生物制造的ADA-GEL/FS復合水凝膠中的活力、形態(tài)、增殖和生物活性。通過活/死染色測定法評估細胞的活力，染色結(jié)果表明細胞在14天后在摻入FS的生物墨水組合物中存活并保持其活力（圖7A）。活細胞（綠色）擴散并覆蓋水凝膠表面，在細胞培養(yǎng)期間甚至培養(yǎng)后期觀察到少量死細胞（紅色）。此外，細胞活力被確定為超過 90%（圖7），這表明生物墨水組合物具有生物相容性適合細胞生長。此外，細胞培養(yǎng)表明MC3T3-E1前成骨細胞在14天的培養(yǎng)中保持活力，沒有任何細胞毒性作用（圖7C-D）。

圖6 純ADA-GEL和FS摻入ADA-GEL細胞水凝膠的細胞毒性評估

5. ADA-GEL/FS水凝膠誘導成骨分化
通過光學顯微鏡（圖7A）和活/死染色（圖7B）觀察到FS顆粒上的細長和擴散細胞顯示出細胞-顆粒相互作用 MC3T3-E1 細胞在聚合物基質(zhì)內(nèi)部和 FS 表面附著并增殖。由于 ADA-GEL/FS 水凝膠有利的微環(huán)境，細胞會在細胞培養(yǎng)期間粘附在結(jié)構(gòu)上并在水凝膠基質(zhì)內(nèi)生長。同時，作者在28天的培養(yǎng)期間，根據(jù)ALP活性（圖7C）和OC分泌（圖7D）評估生物打印ADA-GEL/FS水凝膠內(nèi)MC3T3-E1細胞的分化。

圖7 3D 生物打印水凝膠內(nèi)的MC3T3-E1細胞和FS顆粒相互作用以及ADA-GEL/FS生物打印水凝膠的分化研究

綜上，本文介紹了一種由ADA-GEL和FS顆粒組成的生物墨水配方，作為骨再生的有潛力的候選材料。在材料特性、細胞相容性和成骨分化方面研究了將FS 顆粒添加到 ADAGEL 基質(zhì)中的影響。FS 顆粒均勻分布到 3D 生物打印的水凝膠中，并顯示出與 ADA-GEL 的適當相互作用。生物打印的ADA-GEL/FS 復合水凝膠表現(xiàn)出生物活性以及對MC3T3-E1細胞有利的微環(huán)境。此外，F(xiàn)S 顆粒的摻入還增加了前成骨細胞的細胞增殖和成骨分化。細胞相容性、與骨骼相似的生化成分、獨特的膠原纖維取向、羥基磷灰石含量的天然生物礦化能力以及方便的印刷特性使ADA-GEL/FS 成為一種很有前途的骨修復生物材料。

文章來源：
https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/acb6b7