浙江大學賀永團隊：同軸生物3D打印構(gòu)建可灌注血管芯片

來源：EngineeringForLife  

血管芯片這一概念正日益受到重視，因其可用于研究微尺度流體動力學、組織級別的生物分子傳遞以及良好三維細胞外基質(zhì)微環(huán)境下的細胞間通信。然而目前少有血管芯片能做到長期穩(wěn)定灌流，并著眼于血管新生過程。由于血管新生是腫瘤發(fā)展的必要條件，抗血管新生藥物一直在癌癥治療中發(fā)揮著重要作用。我們以同軸生物打印為工具，構(gòu)建了一種新穎、可靠的抗血管新生藥物篩選血管芯片，該芯片高度模塊化集成，能用于灌流培養(yǎng)和實時觀測。為了在保證良好生物活性的前提下維持載細胞管的液體灌通，受到心臟支架的啟發(fā)，在水凝膠管內(nèi)引入了聚己內(nèi)酯（PCL）支架用于支撐管腔。結(jié)合細胞培養(yǎng)監(jiān)控系統(tǒng)，系統(tǒng)可實現(xiàn)血管新生過程的實時觀測。這項工作開發(fā)了一種用于抗血管新生篩藥的灌流系統(tǒng)，不僅可以進行藥物評估，而且在組織工程、藥代動力學和再生醫(yī)學領域的其他血管模擬場景中也有潛在的用處。

相關研究“Perfusable Vessel-on-a-Chip for Antiangiogenic Drug Screening with Coaxial Bioprinting”近期發(fā)表在International Journal of Bioprinting雜志上，浙大機械學院顧則明博士為第一作者，浙大機械學院賀永教授和謝超淇博士后為共同通訊作者。

圖1 血管新生模型的灌流系統(tǒng)及其生理機制

血管芯片的構(gòu)建流程如下：1. 同軸生物打印載內(nèi)皮細胞的水凝膠管；2. 將載細胞管切成小段并在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-7天，待內(nèi)皮細胞伸展、增殖形成內(nèi)皮化類血管；3. 旋轉(zhuǎn)打印PCL支架；4. 將PCL支架脫模并滅菌；5. 將PCL支架插入內(nèi)皮化類血管結(jié)構(gòu)中；6. 用含VEGF的GelMA生物墨水包裹類血管結(jié)構(gòu)在預先準備的聚乳酸（PLA）框架中澆筑成水凝膠塊；7. 將水凝膠塊放入芯片中，連接上進出口，用螺栓緊固后即可進行灌流培養(yǎng)。

圖2 可灌注血管芯片的構(gòu)建

我們采用生物友好型聚合物PDMS壁和螺栓緊固的安裝方式，有效地實現(xiàn)了長期灌流培養(yǎng)而無漏液、無污染�；�于灌流腔室的精巧設計，裝載著水凝膠塊的PLA框架限位與PLA底板上，而PLA底板又與PDMS壁四角相抵，水凝膠塊在灌流過程中六個方向填充著培養(yǎng)基，確保了水凝膠塊和培養(yǎng)基之間全方位的充分接觸，為水凝膠中的細胞提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)。空心金屬蓋板和透明PET薄膜的使用為血管芯片提供了一個可觀察的窗口。在細胞培養(yǎng)監(jiān)控系統(tǒng)的幫助下，在灌流培養(yǎng)過程中可實時觀察內(nèi)皮細胞的出芽區(qū)域。只要事先設置好合適的焦距和范圍，監(jiān)控系統(tǒng)就會從培養(yǎng)箱中實時傳回出芽區(qū)域的圖像。此外，得益于可快拆的連接接口，該模塊化灌流芯片可以很容易地從灌注系統(tǒng)中分離出來，放在顯微鏡下觀察，而不會造成污染。

圖S3 可快拆的灌流芯片

出于優(yōu)化同軸生物打印過程中的打印參數(shù)、精確構(gòu)建載細胞管的目的，我們分析了明膠和GelMA生物墨水的流變特性，明確了明膠/GelMA生物墨水在升溫與降溫過程中不同凝膠點，這為打印過程中的溫度控制提供了指導。此外，流速分析也確定了最終打印的內(nèi)外徑流速與噴嘴的尺寸。

圖3 GelMA/gelatin生物墨水的可打印性分析

在生物3D打印中，水凝膠結(jié)構(gòu)的生物相容性與結(jié)構(gòu)強度一直是兩個難以調(diào)和的對立面。我們在本項研究中引入了PCL支架用以支撐起柔軟適合細胞生長的水凝膠結(jié)構(gòu)就同時實現(xiàn)了良好的生物活性與灌流通道的無坍塌、無堵塞。我們從力學強度、溶脹后變形程度、不同流速的貫通測試等角度對比了有無PCL支架對水凝膠結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果都證實了PCL支架的必要性。

圖4 有無PCL支架支撐的對比分析

為了表征水凝膠材料的擴散滲透性和內(nèi)皮化預制血管的屏障功能，我們在相同條件下測試了無細胞水凝膠管與內(nèi)皮化類血管結(jié)構(gòu)的FITC標記的葡聚糖擴散實驗。結(jié)果表明了GelMA優(yōu)秀的滲透擴散能力以及載細胞類血管結(jié)構(gòu)中HUVEC之間的緊密連接已形成了良好的屏障功能。

圖5 內(nèi)皮化水凝膠管的屏障功能

為了進一步驗證該內(nèi)皮化類血管結(jié)構(gòu)的功能化，我們對載細胞水凝膠管進行了細胞活性表征，包括擴散、增殖分析等。該內(nèi)皮化水凝膠管的三個視圖和橫截面視圖的共聚焦圖像顯示了內(nèi)皮細胞在生物打印的血管中均勻分布以及HUVEC之間的緊密細胞間連接。再構(gòu)建完血管芯片并灌流培養(yǎng)3天以后，我們對載細胞水凝膠結(jié)構(gòu)進行了免疫熒光染色分析。細胞外基質(zhì)中的黏附蛋白vinculin的出現(xiàn)證實了HUVECs與水凝膠之間產(chǎn)生了牢固的黏附，而ZO-1抗體的表達則顯示了相當緊密的細胞-細胞連接。

圖6 載細胞結(jié)構(gòu)的生物活性表征

在水凝膠塊澆筑時加入的VEGF（200 ng/ml）為內(nèi)皮化類血管中的HUVEC提供了方向性指導，在隨后的灌流培養(yǎng)期間，細胞感應到VEGF的梯度濃度并開始向外出芽。灌流培養(yǎng)3天后，通過共聚焦熒光顯微鏡圖像和光學圖像可以清楚地觀察到HUVEC的出芽。在細胞培養(yǎng)監(jiān)控系統(tǒng)的幫助下，在灌流的前48小時HUVEC的出芽過程被清晰地記錄下來。

貝伐單抗是一種針對VEGF的重組人源化單克隆抗體，已被證明在腫瘤治療中有效。它會搶先與VEGF結(jié)合并抑制其與VEGFR結(jié)合，從而阻止腫瘤血管的維持或發(fā)展。我們采用了三種濃度的貝伐單抗與對照組通過灌流系統(tǒng)進行藥物篩選：10 ng/ml、50 ng/ml和100 ng/ml。灌流培養(yǎng)3天后，不同濃度的貝伐單抗的HUVEC出芽水平不同，與藥物濃度呈負相關。對于不含貝伐單抗的對照組，HUVEC出芽旺盛，而灌注100 ng/ml貝伐單抗的樣品幾乎沒有出芽�；�于這四組模型的光學圖像，我們對不同藥物濃度灌流培養(yǎng)的HUVEC出芽還進行了定量分析。同一視野中出芽數(shù)的差異是巨大的，而出芽平均長度的差異并不大，此外出芽的相對面積也得到了評估，可能由于出芽數(shù)量存在較大差距，相對面積隨著貝伐單抗?jié)舛鹊淖兓�也呈現(xiàn)出顯著差異。

圖7 抗血管新生篩藥模型的應用

文章來源：
http://doi.org/10.18063/ijb.v8i4.619