如何生物3D打印管腔（血管）結(jié)構(gòu)？

組織工程這一概念源于20世紀80年代中期，此項技術(shù)是指利用生物活性物質(zhì)，通過體外培養(yǎng)或構(gòu)建的方法，再造或者修復器官及組織的技術(shù)。這一基本技術(shù)路線使組織工程的研究能夠克服以往在臨床應用的非活性的替代物的諸多缺點，使組織工程的研究在全世界范圍內(nèi)迅速得到了廣泛的關(guān)注。目前組織工程的研究已經(jīng)在構(gòu)建皮膚、軟骨、肝臟、胰腺、骨、肌肉、血管和神經(jīng)等組織器官方面取得了進展。生物3D打印技術(shù)是構(gòu)建組織和類器官的新興技術(shù)，此項技術(shù)運用增材制造的思維，可以構(gòu)建含有活細胞的復雜三維結(jié)構(gòu)。近幾年，此項技術(shù)已取得了長足的進展，然而隨著我們對于人造組織的精度、復雜度的不斷挑戰(zhàn)，過去通用的技術(shù)已經(jīng)難以滿足我們的需求，我們需要新的打印方法來解決組織器官構(gòu)建諸多問題和局限性。的限性出路

當前技術(shù)的局限性

利用當前的通用3D打印技術(shù)所構(gòu)建的組織器官具有以下幾種局限性：

• 雖然我們可以將細胞或材料堆積成三維結(jié)構(gòu)，所打印的組織和類器官的血管化是組織工程的難點所在，傳統(tǒng)生物打印工藝采用線材螺旋堆積的形式進行管腔結(jié)構(gòu)的打印，但是這樣的工藝僅能夠形成管腔結(jié)構(gòu)，難以實際應用。所以，如何在人造組織中構(gòu)建出具有功能性的血管網(wǎng)絡或血管結(jié)構(gòu)是推進組織工程向臨床發(fā)展的一大瓶頸。
• 人體的組織器官形態(tài)多種多樣，其中很大一部分是具有復雜層次的結(jié)構(gòu)（如皮膚的表皮、內(nèi)皮細胞的分層結(jié)構(gòu)；腸道、尿道的管腔結(jié)構(gòu)等）。而生物3D打印作為一種構(gòu)建生物仿生結(jié)構(gòu)的工藝，需要一項可以構(gòu)建復雜層次或管腔結(jié)構(gòu)的工藝技術(shù)。
• 微擠出式生物3D打印工藝是最廣泛使用的打印工藝，因為其可以打印多種細胞和生物材料，并保有良好的細胞活性。但是，由于水凝膠類材料的擠出脹大，此工藝的精度往往有所限制。
• 低黏度材料（如海藻酸鈉）的打印往往困難重重，對于這類材料，交聯(lián)固化的時機尤其重要：提前固化會導致打印噴頭的堵塞；后期固化會導致結(jié)構(gòu)體精度較差。所以亟需一項可以對低黏度材料進行原位固化的技術(shù)。
  
  
  

管腔結(jié)構(gòu)：傳統(tǒng)工藝（左）vs 同軸工藝（右）

同軸工藝解決方案

同軸噴頭系統(tǒng)是將生物3D打印機的兩個或多個噴嘴部分，像“俄羅斯套娃”一樣組合起來，以解決上述生物3D打印的各種痛點：

• 由于同軸噴頭可以輕松地實現(xiàn)管腔結(jié)構(gòu)的打印，所以在構(gòu)建組織的血管化方面又有了新的突破。
• 同軸噴頭技術(shù)由于其天生的多材料復合的特點，可以用于構(gòu)建具有層次或是管腔結(jié)構(gòu)的打印。
• 由于同軸噴頭可以實現(xiàn)噴嘴出口處的快速交聯(lián)，所以此項技術(shù)可以構(gòu)建精度較高的結(jié)構(gòu)。
• 同樣，基于同軸噴頭原位交聯(lián)的特點，低黏度的生物墨水打印的成功率和精度更高，有效的擴充了應用的材料范圍。哈佛大學醫(yī)學院就是利用這樣的技術(shù)實現(xiàn)了高精度且低黏度的墨水打印
  
  
  

高精度、低黏度的同軸打印

Colosi C , Shin S R , Manoharan V , et al. Microfl uidic Bioprintingof Heterogeneous 3D Tissue Constructs Using Low-Viscosity Bioink[J]. AdvancedMaterials, 2016, 28(4):677-684.

應用案例

同軸噴頭技術(shù)的使用大大拓展了我們對于生物3D打印的想象空間，諸多研究者已經(jīng)開始應用這項技術(shù)領(lǐng)域進行耕耘，并在不同的組織或器官方面取得了進展，下面我們來分享其中幾篇典型案例：

軟骨組織

軟骨的自愈能力和創(chuàng)傷響應性較差，往往需要三維組織工程支架輔助修復。由波蘭華沙工業(yè)大學的Wojciech Święszkowski課題組于Biofabrication發(fā)表多篇文章，均利用各類光敏材料如GelMA、CS-AEMA或HAMA，混合海藻酸鈉和源自骨髓的人體間充質(zhì)干細胞（BM-MSC）配置成生物墨水，并利用同軸打印技術(shù)，實現(xiàn)墨水中海藻酸鈉在噴嘴處的同步交聯(lián)，以構(gòu)建具有極高的形態(tài)保真度、細胞存活率和機械性能的軟骨組織結(jié)構(gòu)，是用于軟骨修復的又一有力工具。

Costantini, Marco, Joanna Idaszek, Krisztina Szöke, JakubJaroszewicz, Mariella Dentini, Andrea Barbetta, Jan E. Brinchmann, and WojciechŚwięszkowski."3D bioprinting of BM-MSCs-loaded ECM biomimetic hydrogels for in vitroneocartilage formation." Biofabrication 8, no. 3 (2016): 035002.

肌肉組織

體積性肌肉缺損（VML）是指肌肉出現(xiàn)20%不可逆的缺損，現(xiàn)有技術(shù)利用水凝膠和脫細胞基質(zhì)（dECM）構(gòu)建三維肌肉組織用于VML的修復，但是療效仍有局限性。韓國浦項科技大學的Dong-Woo Cho課題組于Biomaterials發(fā)表研究成果，將dECM制備成生物墨水，通過同軸噴頭將其打印在基于明膠顆粒的懸浮膠中，使其形成外部是血管內(nèi)皮細胞，內(nèi)部是肌肉細胞的復雜肌肉組織。實驗證明這種肌肉組織具有良好的細胞活性，并增強新生肌肉形成能力，而這種復合結(jié)構(gòu)更可以有效的幫助細胞分化和血管化的形成，并提供更好的功能修復，可以有效的促進VML的療效。

Choi, Yeong-Jin, Young-Joon Jun, Dong Yeon Kim,Hee-Gyeong Yi, Su-Hun Chae, Junsu Kang, Juyong Lee et al. "A 3D cellprinted muscle construct with tissue-derived bioink for the treatment ofvolumetric muscle loss." Biomaterials 206 (2019): 160-169.

血管組織
構(gòu)建復雜且具有功能性的人造血管組織結(jié)構(gòu)仍然是組織工程的一大難點。生物3D打印技術(shù)可以有效的構(gòu)建三維血管網(wǎng)絡，以促進氧氣，營養(yǎng)物質(zhì)和廢物的運輸。美國哈佛大學醫(yī)學院于Biomaterials發(fā)表研究，提出了一種可以構(gòu)建可灌注血管結(jié)構(gòu)的工藝方法。研究團隊將光敏材料GelMA、PEGTA與海藻酸鈉混合制成生物墨水，通過多層同軸噴頭進行打印，實現(xiàn)墨水中海藻酸鈉在噴嘴處的同步交聯(lián)，并直接形成管狀結(jié)構(gòu)，后續(xù)通過進一步光固化和海藻酸鈉洗脫，最終形成可灌注血管結(jié)構(gòu)。這樣的復合材料具有良好的生物學性能，有效促進內(nèi)皮細胞和干細胞在結(jié)構(gòu)中的擴散和增值。這種新技術(shù)可以高效構(gòu)建大尺寸血管化組織的構(gòu)建，并在未來中應用于器官移植和修復。

Jia, Weitao, P. Selcan Gungor-Ozkerim, Yu ShrikeZhang, Kan Yue, Kai Zhu, Wanjun Liu, Qingment Pi et al. "Direct 3Dbioprinting of perfusable vascular constructs using a blend bioink."Biomaterials 106 (2016): 58-68.

細胞免疫研究
調(diào)節(jié)性T細胞（Treg），其固有的抑制功能是免疫系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)劑。離體擴增Treg的系統(tǒng)性過繼轉(zhuǎn)移已經(jīng)被廣泛研究用于異體移植。由于目前Treg的擴增方法耗時且昂貴，來自澳大利亞阿德萊德大學的Patrick Toby Coates課題組于Advanced Functional Materials雜志發(fā)表一項研究，該研究首次報道了用于天然免疫抑制的人天然和誘導的Treg的水凝膠包裹培養(yǎng)。該研究將鼠胰島與人天然和誘導的Tregs同軸打印，打印體在與人外周血單核細胞共培養(yǎng)后，保護胰島免受異種反應。這種通過同軸3D生物打印建立了Treg的共包裹培養(yǎng)，是為同種異體細胞移植（例如胰島）提供局部免疫保護的有效選擇。Kim, J., Hope, C. M., Gantumur, N., Perkins, G.B., Stead, S. O., Yue, Z., … Coates, P. T. (2020). Encapsulation of HumanNatural and Induced Regulatory T‐Cells in IL‐2 and CCL1 SupplementedAlginate‐GelMA Hydrogel for 3D Bioprinting. Advanced Functional Materials,200054


隨著技術(shù)水平的不斷進步，同軸噴頭系統(tǒng)也將取得進一步的拓展和豐富。目前，已經(jīng)有研究者實現(xiàn)具有多層次套管組織的打印，多材料的復合使用是同軸噴頭技術(shù)的下一步方向。UCLA的AliKhademhosseini教授團隊，就使用同軸噴頭打印了含有多層細胞套管的管腔結(jié)構(gòu)。上普生物研發(fā)出同軸噴頭并廣泛應用到血管化組織打印，高精度打印等領(lǐng)域