3D打印技術(shù)在進化：3D梯度水凝膠提供人造細胞生態(tài)位

帶狀組織在軟骨結(jié)構(gòu)和功能上起著重要的作用，然而迄今為止開發(fā)的大多數(shù)組織工程策略只能允許具有均勻生化和機械特征的軟骨再生。為了更好地還原組織結(jié)構(gòu)和功能，對于具有仿生梯度生態(tài)位特征的工程材料有巨大的需求，這些材料可以重現(xiàn)原生組織。為了解決這個關(guān)鍵的未滿足需求，據(jù)南極熊了解，近日，斯坦福工程師們成功地將軟骨樣細胞和間充質(zhì)干細胞裝入3D水凝膠。

據(jù)悉，這是一種快速形成組織梯度水凝膠作為具有生化和物理特性可調(diào)的3D細胞生態(tài)位方式。當密閉在硬度梯度水凝膠中時，軟骨細胞和間充質(zhì)干細胞都顯示出帶狀特異性的反應和細胞外沉積，這可模擬了關(guān)節(jié)軟骨組織的區(qū)域構(gòu)成。使用blebbistatin阻斷細胞機械感應消除了具有硬度梯度的3D水凝膠中的軟骨細胞帶狀區(qū)反應。這樣的組織大小的梯度水凝膠可以提供3D人造細胞生態(tài)位，從而使各種組織類型能夠打印帶狀結(jié)構(gòu)或者組織接觸面。

盡管帶狀結(jié)構(gòu)在軟骨結(jié)構(gòu)和功能中起重要作用，但迄今研發(fā)的大多數(shù)組織工程策略只允許具有均勻的生化和機械特征的軟骨再生。軟骨損傷是極為常見的，但是由于軟骨的弱細胞性和無血管的特性，軟骨具備有限的自愈能力。由于關(guān)節(jié)軟骨從淺表層轉(zhuǎn)移到深層，軟骨的細胞外基質(zhì)（ECM）的硬度開始增加，ECM的成分如葡糖氨基葡聚糖的含量增加，以及肥厚性軟骨標志物如X型膠原蛋白含量增加。
研發(fā)了各種策略進行具有梯度信號的生物材料的制備，并作為細胞的生態(tài)位，例如靜電紡絲，模塊化水凝膠體系，激光掃描光刻，對流擴散，微流體以及融合預制化微球。然而，這些策略中的絕大部分通常需要冗長的制造過程或者使用非細胞友好性的試劑，這不能夠保證可通過均勻方式進行細胞封存的組織標尺的梯度生物材料的制造。因此，在三維空間中，梯度生態(tài)位置如何影響細胞介導的組織形成，在很大程度上尚未可知。此外，雖然最近的研究在針對力學信號（如基質(zhì)的硬度）在調(diào)節(jié)各種細胞命運（包括細胞的增殖和分化）的作用上取得了突破，但是激活或者阻斷機械感應如何影響3D組織中細胞命運和ECM的形成仍有待研究。

來源：Tissue Engineering

為了將帶狀結(jié)構(gòu)設(shè)計為工程軟骨，一種策略是將軟骨細胞進行模式分類，從有不同區(qū)域帶狀特異性表型的軟骨細胞，到不同層化的軟骨細胞。利用連續(xù)的光聚合，多層水凝膠可以從不同的區(qū)域中被分離出來，并被封裝在不同的層中，以更好地模擬體內(nèi)帶狀結(jié)構(gòu)。另一種策略是利用單一的細胞來源，利用多層的水凝膠，利用不同的生化和機械性能，進行基質(zhì)特征的模式歸類。

在介導細胞命運和組織形成方面，生物化學和物理的特征都發(fā)揮了重要作用。間質(zhì)干細胞(MSCs)和一種被包裹在多層支架上的軟骨細胞表現(xiàn)出帶狀特異性的分化，這些多層支架具有空間變化的基質(zhì)組分和機械特征。雖然上述的策略已經(jīng)改善了用均勻的水凝膠獲得的工程軟骨的帶狀結(jié)構(gòu)，但獲得的組織顯示出了獨特的層，而原生軟骨則以連續(xù)的梯度方式過渡。此外，由于界面上的水凝膠硬度的不連續(xù)性，層間界面往往是脆弱的，容易受到機械應力的影響下分離。

與多層水凝膠相反，仿生梯度水凝膠在生物化學和/或機械特征上具有連續(xù)的變化，從而在在體內(nèi)可更精確的模擬組織連接和帶狀結(jié)構(gòu)形成。為了來更好地模擬骨和軟骨接觸面，進行MSCs在3D空間中的帶狀特異性分化的誘導，容納可溶性因子梯度的水凝膠通過含有不同梯度的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（rhBMP-2）和胰島素生長因子（rhIGF-1）的微球體所制造出來。

另外，還制備了不同基質(zhì)硬度的水凝膠，并使用發(fā)育信號誘導區(qū)域依賴性的MSC分化。還使用具有生物化學特征的聚丙烯酰胺（PAAM）水凝膠來制備含有不溶性基質(zhì)梯度（例如,硬度）的水凝膠。此外，還開發(fā)了一種基于微流體的方法，制備雙梯度聚乙二醇(PEG)水凝膠，其包含了化學和物理梯度，但這種微尺度平臺不適合用于臨床空間上制造組織大小的梯度水凝膠。

雖然細胞在體內(nèi)的3D生態(tài)位存留，但以前的報告主要局限于2D研究，這是因為在組織規(guī)模的三維梯度水凝膠中以快速和細胞友好的方式封裝細胞是一項挑戰(zhàn)。因此，仍然迫切需求開發(fā)一種生物材料平臺，通過這個平臺可以對在3D中的組織梯度水凝膠中的細胞進行研究。目前研究的目的是開發(fā)一種細胞兼容性好的方法，用于制造組織大小的梯度水凝膠作為3D細胞特征，從而指導帶狀結(jié)構(gòu)的軟骨再生。

我們假設(shè)具有硬度梯度的水凝膠將會誘導封存細胞在3D空間中產(chǎn)生帶狀特異性反應，并且通過梯度水凝膠中新沉積的組織來模擬本身關(guān)節(jié)軟骨的帶狀結(jié)構(gòu)。為了測試這個假設(shè)，將新生的牛軟骨細胞或者人骨髓間充質(zhì)干細胞密閉在3D梯度水凝膠中7或21天。使用機械測定、定量基因表達、生化檢驗和組織學來評價梯度水凝膠中新形成組織的情況。

來源：科學橋研究院