3D打印技術(shù)結(jié)合PDGFB-LG4融合蛋白，破解骨缺損修復(fù)難題

來源：EngineeringForLife

骨組織工程的一個(gè)中心重點(diǎn)是構(gòu)建血管系統(tǒng)，為細(xì)胞生存提供營養(yǎng)，清除代謝廢物，并加速組織再生。血小板衍生生長因子-BB（PDGFB）具有刺激血管形成和骨再生的能力；然而，由于給藥系統(tǒng)不理想，其臨床應(yīng)用受到副作用和低療效的阻礙。

近期，南京大學(xué)趙建寧/上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院雷東團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種與硫酸乙酰肝素（HS）交聯(lián)的仿生血管支架，用于持續(xù)遞送PDGFB變體，以促進(jìn)臨界大小骨缺損的再生（圖1）。

相關(guān)研究成果以“3D-Printed Biomimetic Vascular Scaffold Crosslinked with Heparan Sulfate for Sustained Release of PDGFB-LG4 Fusion Protein Promotes Bone Regeneration”為題于2025年3月27日發(fā)表在《Advanced Science》上。

圖1 PCLHS-PDGFB-LG4支架制備示意圖

1. 仿生血管支架的制備及表征
研究者采用了一種反向成型3D打印方法來制造具有血管樣層次結(jié)構(gòu)的仿生血管支架（圖1）。通過加熱使蔗糖逐漸焦糖化，從而獲得良好的擠出成型性，使用3D打印機(jī)將焦糖墨水?dāng)D出成連續(xù)的單纖維（圖2C）。根據(jù)打印路徑，將熔化的焦糖墨水堆疊成多層層板，形成模板（圖2D、E）。3D打印參數(shù)直接影響模板的宏觀和微觀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響仿生血管網(wǎng)絡(luò)支架的形態(tài)。SEM顯示，支架展現(xiàn)出多級(jí)血管樣結(jié)構(gòu)（圖2G）。微通道堆疊形成多層中空框架，通道相互連接形成多分支網(wǎng)絡(luò)。通道表面存在大量微孔，使通道壁具有滲透性。這種血管樣結(jié)構(gòu)能夠支持生理相關(guān)的灌注，模擬三維中的微血管網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行物質(zhì)傳遞。盡管通道壁薄且多孔，但支架展現(xiàn)出良好的延展性（圖2H）。單軸壓縮測(cè)試表明，支架的模量為13.4 ± 1.7 kPa（圖2I）。此外，循環(huán)壓縮測(cè)試顯示支架具有優(yōu)越的彈性和抗疲勞性能，在動(dòng)態(tài)壓力下幾乎沒有滯后現(xiàn)象（圖2J）。支架的彈性使其能夠抵抗多種拉伸和壓縮變形，并在各種應(yīng)用中保持原始管狀結(jié)構(gòu)。   

圖2 仿生支架的表征

2. 硫酸乙酰肝素與仿生血管支架的結(jié)合和蛋白質(zhì)釋放
隨后，研究者通過XPS確認(rèn)了HS在PCL支架表面的成功涂層，結(jié)果顯示PCLHS支架在168.86 eV處有一個(gè)峰值，對(duì)應(yīng)于PCLHS支架表面存在的S原子（圖2K、L）。甲苯藍(lán)染色進(jìn)一步證明了HS成功交聯(lián)到支架上（圖2F）。此外，還研究了PDGFB和PDGFB-LG4在PCLHS支架上的釋放行為，結(jié)果表明PDGFB的釋放速率更快，而PDGFB-LG4的釋放速率相對(duì)較慢，這表明HS對(duì)PDGFB-LG4具有更強(qiáng)的吸附性，顯示出高親和力，從而延遲了PDGFB-LG4的釋放（圖2M）。這些結(jié)果表明，HS能夠有效地與支架結(jié)合，并通過靜電相互作用延遲PDGFB-LG4的釋放，從而實(shí)現(xiàn)更持久的蛋白質(zhì)釋放。   

3.體外細(xì)胞增殖和附著測(cè)定
通過CCK-8實(shí)驗(yàn)評(píng)估了HS、PDGFB和PDGFB-LG4對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）增殖的影響，結(jié)果顯示， HS、PDGFB和PDGFB-LG4組在1、3和5天時(shí)的細(xì)胞增殖顯著增加（圖3M、N）。此外，細(xì)胞附著實(shí)驗(yàn)表明，只有PDGFB-LG4顯著增強(qiáng)了兩種細(xì)胞的附著，而HS和PDGFB單獨(dú)使用時(shí)未顯示出對(duì)細(xì)胞附著的改善（圖3L）。這些結(jié)果表明，PDGFB-LG4在促進(jìn)細(xì)胞增殖和附著方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，這可能與其通過靜電相互作用與HS結(jié)合的能力有關(guān)，從而延長了其在支架上的保留時(shí)間，增強(qiáng)了局部治療效果。   

圖3 HS和PDGFB變體的成骨和血管生成潛力

4.成骨活性及血管生成活性分析
研究者通過堿性磷酸酶（ALP）活性檢測(cè)、鈣沉積分析和成骨相關(guān)基因表達(dá)的評(píng)估來分析這些物質(zhì)的成骨效果。ALP染色結(jié)果顯示， HS、PDGFB和PDGFB-LG4組在培養(yǎng)7天和14天時(shí)顯著增強(qiáng)了BMSCs的ALP活性，其中PDGFB-LG4組的ALP活性最高（圖3A、C）。礦化沉積結(jié)果顯示PDGFB-LG4組的礦化基質(zhì)形成最為顯著（圖3B、D）。此外，通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，HS和PDGFB-LG4顯著上調(diào)了成骨相關(guān)基因的表達(dá)（圖4E）。這些結(jié)果表明，HS和PDGFB-LG4顯著促進(jìn)了BMSCs的成骨分化，且PDGFB-LG4在促進(jìn)ALP活性和鈣沉積方面比PDGFB更有效，顯示出更強(qiáng)的成骨誘導(dǎo)能力。   

研究者通過劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和體外管狀形成實(shí)驗(yàn)來評(píng)估這些物質(zhì)對(duì)細(xì)胞遷移和血管生成的促進(jìn)作用。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)顯示，PDGFB和PDGFB-LG4組的細(xì)胞遷移能力顯著優(yōu)于對(duì)照組，尤其是PDGFB-LG4組在24小時(shí)（BMSCs）和48小時(shí)（HUVECs）時(shí)的傷口閉合率最高（圖3E、H）。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了PDGFB變體誘導(dǎo)HUVECs遷移的潛力，PDGFB-LG4組的遷移細(xì)胞數(shù)量顯著多于PDGFB組（圖3F、I）。體外管狀形成實(shí)驗(yàn)表明，PDGFB和PDGFB-LG4組的HUVECs形成的管狀網(wǎng)絡(luò)參數(shù)（分支數(shù)量和總分支長度）顯著優(yōu)于對(duì)照組，但兩組之間沒有顯著差異（圖3G、J、K）。這些結(jié)果表明，PDGFB-LG4在促進(jìn)細(xì)胞遷移和血管生成方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，可能與其通過靜電相互作用與HS結(jié)合的能力有關(guān)，從而延長了其在支架上的保留時(shí)間，增強(qiáng)了局部治療效果。

5. 復(fù)合支架的生物相容性和成骨評(píng)價(jià)
隨后，研究者通過CCK-8實(shí)驗(yàn)和活死染色評(píng)估了BMSCs和HUVECs在不同復(fù)合支架上的細(xì)胞增殖和生物相容性。CCK-8結(jié)果顯示，所有組的細(xì)胞數(shù)量在5天內(nèi)均有所增加，其中PCLHS-PDGFB和PCLHS-PDGFB-LG4組的細(xì)胞增殖顯著高于其他組（圖4C、D）。活死染色顯示，BMSCs和HUVECs在所有組中均能有效粘附和鋪展，表明良好的生物相容性（圖4A、B）。此外，通過qRT-PCR分析了BMSCs在不同復(fù)合支架上培養(yǎng)14天后的成骨相關(guān)基因表達(dá)，結(jié)果顯示PCLHS-PDGFB-LG4組的成骨相關(guān)基因表達(dá)最高（圖4F）。RNA測(cè)序進(jìn)一步揭示了PCLHS-PDGFB-LG4組與PCLHS-PDGFB組相比，激活了NF-kappa B信號(hào)通路和細(xì)胞粘附分子，這些信號(hào)通路的激活有助于增強(qiáng)BMSCs的成骨分化（圖5）。這些結(jié)果表明，PCLHS-PDGFB-LG4復(fù)合支架在促進(jìn)細(xì)胞增殖和成骨分化方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。   

圖4 復(fù)合支架的生物相容性和體外成骨  

圖5 復(fù)合支架的RNA-seq結(jié)果

6. 復(fù)合支架促進(jìn)體內(nèi)骨形成

研究者在大鼠顱骨缺損模型中評(píng)估了不同支架的骨再生效果。通過micro-CT分析，結(jié)果顯示PCLHS-PDGFB-LG4組在4周和8周時(shí)的新骨形成量顯著高于其他組（圖6A）。骨體積與總體積比（BV/TV）和覆蓋分析進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果（圖6B、C）。組織學(xué)分析顯示，PCLHS-PDGFB-LG4組在缺陷區(qū)域中心觀察到明顯的骨組織形成，且無明顯炎癥反應(yīng)或壞死，表明支架具有良好的生物相容性（圖7A、B）。免疫熒光染色顯示，PCLHS-PDGFB-LG4組在CD31、COL1和RUNX2的表達(dá)上顯示出最高的熒光信號(hào)，表明其在血管化和骨再生方面的優(yōu)越性（圖8）。這些結(jié)果表明，PCLHS-PDGFB-LG4復(fù)合支架在體內(nèi)能夠顯著促進(jìn)骨形成和血管化，且在較低劑量下表現(xiàn)出比PDGFB更好的骨再生效果。   

圖6 不同支架的體內(nèi)骨再生評(píng)估

圖7 通過組織學(xué)染色評(píng)估體內(nèi)骨再生

圖8 通過免疫熒光染色評(píng)估體內(nèi)骨再生

綜上，本文成功設(shè)計(jì)了一種與HS交聯(lián)的仿生血管支架，用于持續(xù)遞送PDGFB-LG4融合蛋白，在較低劑量下促進(jìn)骨再生。維管狀支架具有多分支微通道和可滲透多孔壁，促進(jìn)質(zhì)量交換和細(xì)胞浸潤。與PDGFB相比，PDGFB-LG4表現(xiàn)出優(yōu)異的骨誘導(dǎo)和血管生成活性。這種方法可能適用于其他生長因子和明膠基材料，在再生醫(yī)學(xué)中具有廣泛的應(yīng)用潛力。  

參考資料：https://doi.org/10.1002/advs.202414362