3D生物打印仿生多層皮膚以改善傷口愈合

來源： 光譜與液芯器械醫(yī)工交叉團隊

修復全層皮膚缺損是臨床實踐中的一大挑戰(zhàn)�；罴毎�和生物材料的生物打印是解決該挑戰(zhàn)的一種很有前途的技術。然而，有限的生物材料來源、耗時的材料準備及其成型工藝是必須解決的瓶頸�；�于此，來自解放軍總醫(yī)院的Minliang Chen團隊在《ACS Applied Materials & Interfaces》期刊發(fā)表了題為“3D-Bioprinted Biomimetic Multilayer Implants Comprising Microfragmented Adipose Extracellular Matrix and Cells Improve Wound Healing in a Murine Model of Full-Thickness Skin Defects”的文章。該研究開發(fā)了一種新穎、快速且簡單的方法。該方法直接處理脂肪組織以獲得微碎片脂肪ECM(mFAECM)，但它無法打印。為了使mFAECM具有可打印性，將其與甲基丙烯�；�明膠(GelMA)和甲基丙烯�；�透明質酸(HAMA)混合制成復合生物墨水。同時，本研究以mFAECM為生物墨水主要成分，制備出對應真皮、表皮、血管化的不同生物墨水，完成仿生多層皮膚的生物打印。傷口愈合試驗顯示出生物打印的皮膚具有良好的治療效果。

1、mFAECM的制備和表征

脂肪抽吸物經(jīng)過三次凍融循環(huán)后均質化，得到均勻的乳化懸浮液。離心后，產(chǎn)品上層呈透明油狀，中層呈淡黃色ECM，底層呈大而粗的纖維。獲得 ECM后，用異丙醇反復萃取，直至無黃色油狀物殘留。均質后的ECM具有均勻致密的絮狀外觀。DAPI染色顯示ECM碎片小于100 μm × 200 μm，因此可以輕松穿過內徑為 300 μm的噴頭。對mFAECM和天然組織主要成分的分析表明，膠原蛋白含量分別為110.38±9.60μg/mg和99.2±10.54μg/mg，sGAG(糖胺聚糖)含量分別為2.85±0.35μg/mg和3.11±0.40μg/mg。這表明天然組織的大部分膠原蛋白和sGAG保留在mFAECM中。膠原蛋白和糖胺聚糖對組織再生很重要，并負責調節(jié)傷口愈合過程中的組織穩(wěn)態(tài)、細胞遷移和細胞信號傳導。

圖 1. mFAECM的制備和特性

2、仿生多層皮膚的制造
為了評估m(xù)FAECM復合生物墨水的可打印性，該研究應用3D打印制造了圓形、網(wǎng)狀四層結構。該結構具有高保真度，并且與設計圖案高度一致。高清相機拍攝的圖像顯示，生物墨水軌跡保持連續(xù)，每條細絲獨立分布，不會合并或折疊。SEM圖像顯示細胞附著在孔隙上。總之，mFAECM復合生物墨水具有良好的可打印性和保真度，可以支持細胞附著。

圖 2. 仿生多層皮膚的制造和微觀結構

3、仿生多層皮膚促進小鼠的皮膚傷口愈合

目前還沒關于直接將脂肪來源的、未經(jīng)胃蛋白酶消化的ECM應用于生物打印構建皮膚的研究。為了評估由mFAECM和細胞組成的生物打印多層皮膚對體內傷口愈合的影響，該研究在裸鼠中制備了全層皮膚缺損模型。植入后第7天，細胞負載組創(chuàng)面面積最小，空白組創(chuàng)面面積最大。第14天，僅細胞負載組創(chuàng)面已完全閉合。形態(tài)學分析表明，生物打印仿生多層皮膚的創(chuàng)面愈合效果最好。H&E染色表明，植入后7天，細胞負載組修復效果優(yōu)于脫細胞組和空白組。細胞負載組大部分表皮結構已形成，脫細胞組仍被構建體覆蓋。空白組以血痂和脆弱的肉芽組織為主。14天時，細胞負載組和脫細胞組的表皮結構更加完整。與脫細胞組相比，細胞負載組的真皮結構分布更均勻，血管和纖維組織清晰可見。

圖 3. 全層皮膚缺損小鼠的傷口愈合

4、仿生皮膚增強體內血管生成和膠原蛋白合成

組織工程最艱巨的挑戰(zhàn)之一是新血管形成，它與營養(yǎng)物質向目標組織的輸送直接相關。CD31是一種血管內皮細胞標記物，用于評估傷口愈合過程中的新毛細血管。免疫組化結果發(fā)現(xiàn)CD31表達在細胞負載組中明顯較高。此外，RT-qPCR 分析顯示，在第7天和第14天，載細胞組的VEGF表達明顯高于無細胞組和空白組(見補充材料)。因此，可以發(fā)現(xiàn)仿生皮膚通過促進血管生成來加速傷口愈合。

圖 4. 仿生多層皮膚對血管形成的影響

膠原蛋白在傷口愈合中起著重要作用，它提供組織強度，并促進細胞粘附和遷移。采用MT染色評估仿生多層皮膚對傷口膠原沉積的影響。與空白組相比，植入后第7天和第14天，載細胞和脫細胞植入物治療的傷口中觀察到更多的膠原纖維，且排列更有序。第7天，載細胞組的膠原面積明顯大于脫細胞組和空白組。第14天，細胞負載組膠原面積也明顯高于無細胞組和空白組。

圖 5. 仿生多層植入物對膠原蛋白沉積的影響

5、總結
該研究描述了一種快速簡便的方法，直接處理脂肪組織以獲得mFAECM，并將它用作生物墨水的主要成分，以制造生物打印的載細胞仿生多層皮膚。結果表明，mFAECM復合生物墨水具有良好的可打印性和保真度，并能支持細胞粘附。仿生多層皮膚可以加速傷口愈合。這項研究提供了一種有效的方法來提高生物打印皮膚替代品的快速制造，這對于大規(guī)模全層皮膚缺損治療至關重要。