基于透明質酸的新型生物墨水開發(fā)及其在生物3D打印含神經分布的干細胞源性角膜基質...

背景介紹

生物3D打印允許將細胞精確地沉積在模仿天然組織的復雜和不規(guī)則形狀的結構體中。此前，人類角膜基質模擬結構已經通過基于擠出的打印技術、激光輔助的生物3D打印技術和立體光刻進行了生物3D打印。雖然生物3D打印在制造角膜模擬結構方面具有巨大的潛力，但是目前的技術方法僅僅集中在忽視角膜微結構的3D 宏觀形狀上。

以點擊化學為基礎的水凝膠是自發(fā)形成的混合反應化合物，這些反應是快速的、自發(fā)的、多功能的和極具選擇性的。通常，疊氮炔環(huán)加成反應、 Diels-Alder 反應和巰基烯化學由于反應組分和原子經濟性反應產物的雙正交性而被稱為點擊化學。然而，這些方法并不適用于制造生物墨水與活細胞的3D 打印，因為他們需要嚴格的反應條件，有毒催化劑或高溫。腙交聯(lián)是由雙正交官能團，即醛基和肼基之間的動態(tài)共價偶聯(lián)形成的一種快速有效的偽點擊反應。以 HA 為基礎的腙交聯(lián)水凝膠已經被研究用于模擬角膜結構的組織工程。然而，HA 基水凝膠的腙交聯(lián)的凝膠時間很快(< 30s) ，導致生物制備窗口狹窄，因此這些水凝膠不能用作生物3D打印的生物墨水。因此，基于化學點擊的水凝膠如何提供理想的生物制造窗口、高分辨率和細胞活力的新型生物墨水是基于擠出的生物3D打印的迫切需要。這種生物墨水可以使用動態(tài)共價化學來制備，這種化學是快速和有效的，不需要任何催化劑或光源。

研究開發(fā)了一種基于 HA 的生物墨水，可以用于人類角膜基質仿生結構的生物3D打印。所開發(fā)的水凝膠滿足下一代生物墨水的要求，包括優(yōu)異的打印性，形狀保真度以及與人脂肪干細胞(hASC) ，hASC 衍生的角膜基質細胞(hASC-CSKs)和 hPSC- 神經元的細胞相容性。此外，研究還探索了幾種用于角膜基質生成的生物3D打印策略，并分析了所得到的基質仿生結構的微觀結構。研究通過在豬角膜器官培養(yǎng)模型中驗證生物3D打印角膜基質的組織整合。最后，為了證明所開發(fā)的生物墨水和生物3D打印的角膜基質的實用性，研究探索了對打印角膜基質的神經支配，并制作了具有神經支配的第一個生物3D打印的角膜基質組織模型。

本研究合成了四種生物墨水組分：①多巴胺與透明質酸(HA-DA)的接枝；②利用碳二酰亞胺偶聯(lián)化學進行碳二酰肼(CDH)與透明質酸(HA-CDH)的綴合；③多巴胺修飾的透明質酸(HA-DA-CDH)上接合 CDH；④HA-醛(HA-Ald)的合成。使用兩種 HA 基腙交聯(lián)生物墨水，以評估共軛多巴胺對生物墨水特性的影響。第一種生物墨水含有 HA-CDH 和 HA-Ald 作為交聯(lián)組分(HA 生物油墨)和另一種 HA-DA-CDH 和 HA-Ald (HA-DA 生物油墨)。用紫外-可見分光光度法在標準曲線的線性部分畫出最佳擬合線，測定 HA-DA 對透明質酸雙糖重復單位的多巴胺功能化程度為4.5 mol%。DA 顯示出與文獻一致的以下特征峰: 3345cm-1(胺 N-H 拉伸) ，3039cm-1(芳香族 O-H 拉伸) ，2946cm-1(烷基 C-H 拉伸) ，1614cm-1(胺 N-H 彎曲) ，1493cm-1(芳香族 C = C 拉伸)和650-1300cm-1區(qū)域中由于脂肪鏈的幾個峰。HA 和 HA-DA 都在3100 ~ 3600cm-1處出現(xiàn)寬峰，這是由于 -OH 基團和胺N-H 基團的伸縮振動所致。研究還觀察到，由于透明質酸骨架中的 C-O-C 半縮醛糖單位，在1033-1152cm-1附近出現(xiàn)峰值。HA 和 HA-DA 中還存在羧酸鹽在1375-1405cm-1附近的不對稱伸縮振動，-CH2基團在2895cm-1附近的對稱伸縮振動，酰胺 I 和 II 在1550-1561cm-1附近的條帶。在 HA-DA 的情況下，由于 DA 與 HA 的羧基結合，在1645cm-1和1733cm-1處出現(xiàn)獨特的 C = O 和酰胺拉伸。

通過打印雙層網格評價了 HA 基生物墨水的可打印性。HA 生物墨水在打印時沒有形成長絲(圖1(f)) ，表現(xiàn)為流體狀，并且在打印過程中未能維持打印網格結構。相比之下，HA-DA 生物墨水顯示出良好的長絲形成與和清晰的網格結構。在這里，一個90分鐘的生物制造窗口獲得 HA-DA 生物墨水打印。隨后，研究進一步分析了 HA-DA 生物墨水的形狀保真度，打印六層后立即測量334 ± 58μm 的網格線厚度(圖1(g))。在培養(yǎng)的7天內，只有363 ± 77μm 的輕微增加。打印后立即獲得0.95 ± 0.04的 PR，培養(yǎng)7天后僅略有下降至0.92 ± 0.02(圖1(h))。經過七天的培養(yǎng)，打印的格子結構是均勻的，清晰可見的網格結構和開放的孔(圖1(i))。

圖1. HA-DA 生物油墨可支持高精度打印，具有良好的形狀保真度和自愈合性能。(a) HA-DA 和 HA 生物油墨在連續(xù)流動下的剪切變稀。(b) HA-DA 和(c) HA 生物油墨在循環(huán)應變下的剪切變稀。(c)完全交聯(lián)(d) HA-DA 生物油墨和(e) HA 生物油墨的應變回收率。(f)具有兩個不同印刷參數(shù)的 HA 和 HA-DA 生物油墨的可打印性。比例尺5毫米。(g)纖維厚度和(h)孔隙因子評估印刷 HA-DA 生物油墨結構的形狀保真度。(i)打印后和培養(yǎng)七天的印刷格子圖像。比例尺5毫米。(j)三維生物打印結構的儲存模量，表明培養(yǎng)結構的穩(wěn)定性。(k)印刷結構隨時間的降解和膨脹行為。(l) HA-DA 生物油墨的透過率。(m) HA-DA 生物油墨在定量機械壓縮試驗中表現(xiàn)出組織自愈合特性。

為了探究 HA-DA 生物墨水的細胞相容性，研究將生物3D打印的 hASC 和 hASC-CSK 分成二維培養(yǎng)和三維培養(yǎng)。研究在打印一天和七天后評估細胞的活力，兩組細胞均有 > 95% 的高細胞活力(圖2(a))。死亡細胞的數(shù)量在培養(yǎng)時沒有增加。與 hASC-CSK 相比，hASC 在打印過程中的存活率略高(圖2(a))。免疫熒光(IF)染色和 PrestoBlueTM 分析進一步驗證細胞相容性。用鬼筆環(huán)肽對打印線條進行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)1天后兩種細胞類型的細胞形態(tài)均拉長(圖2(b))。直到第7天，hASC 檢測到細胞數(shù)量明顯增加，在此期間，它們仍然按照原來的打印模式保持對齊。在第1天和第3天，hASC-CSK 的數(shù)量略有增加，然而此后沒有明顯的細胞增殖。兩種細胞在打印后均表達增殖標志物 Ki67。與第1天和第3天相比，第7天在兩個層狀細胞系和三維基質結構中 hASCs 顯示出更高的細胞增殖(p < 0.001)。另外，hASC-CSK 表現(xiàn)出強烈的 lumican 表達(圖2(e))。為了進一步評估打印基質結構中的組織形成，研究在打印14天后對3D 基質結構進行了共聚焦成像。檢測到兩種細胞類型的縫隙連接蛋白連接蛋白43(Cx43)的陽性染色，表明在打印結構中形成細胞-細胞相互作用(圖2(f))。在兩種細胞類型的三維共聚焦圖像中也可以看到細胞形態(tài)和細胞網絡(圖2(g)-(h))。

圖2. HA-DA 生物墨水與 hASC 及 hASC-CSK 的細胞相容性研究。(a)打印后7天(活細胞 = 綠色，死細胞 = 紅色) ，以線性結構和3D 結構打印的細胞存活率。(b)打印后一天，三天和七天打印行中 hASC 和 hASC-CSK 的細胞骨架(鬼筆環(huán)肽 = 紅色)和增殖細胞(Ki67 = 綠色)。比例尺500微米。用 PrestoBlueTM (* * = p < 0.001)分析打印1,3和7天后，以線性結構(c)和3D 結構(d)打印的 hASC 和 hASC-CSK 的細胞增殖。(e)打印品打印7天后的細胞形態(tài)、增殖和角膜基質標記物表達。增殖細胞對 Ki67(綠色)染色，鬼筆環(huán)肽(紅色)顯示細胞形態(tài)，Lumican (紫色)檢測角膜基質標記物表達。比例尺200微米。(f)打印后14天后生物3D打印基質中細胞-細胞相互作用的共聚焦圖像。用鬼筆環(huán)肽(紅色)觀察細胞骨架，用間隙連接蛋白 Cx43(綠色)觀察細胞-細胞相互作用。(g)打印14天后細胞在3D 結構中的3D 旋轉共焦圖像。(h)來自三維旋轉共焦圖像的生物3D打印結構的側面圖。比例尺100μm。

應用HA-DA生物墨水實現(xiàn)角膜基質結構的生物3D打印

接下來，研究探討了三種不同的角膜基質組織工程打印策略，并探討了打印結構體在培養(yǎng)上的相似性。將未分化的 hASC 在生物打印后也被打印并保存在它們的增殖培養(yǎng)基中。在預分化打印方法中，hASC 在打印前被預分化為 CSK。在打印后誘導分化方法中，通過將打印結構置于 CSK 分化培養(yǎng)基中，在打印印后開始 hASC 向 CSK 的分化。以上三種打印策略的生物3D打印結構表明，當用 HE 染色檢查橫截面時，hASC 和 hASC-CSK 均在整個3D 結構中稀疏地分布(圖3(a)和(b))。hASCs 在整個打印結構中呈拉長的細胞形態(tài)，打印前分化 hASC-CSK 的方法也可以觀察到類似的形態(tài)。相比之下，在打印后分化的 hASC-CSK 的橫截面上看到的延伸率要小得多(圖3(a)和(b))。在不同打印策略的培養(yǎng)過程中，細胞形態(tài)有很大的差異(圖3(c))。在打印結構中，hASCs 呈細長的細胞形態(tài)和致密的細胞網絡，而分化的 hASC-CSK 均表現(xiàn)出較多的樹突狀細胞形態(tài)，細胞體呈圓形，細胞外延較少。所有的打印方法中均可以觀察到針對細胞-細胞相互作用的Cx43染色陽性 (圖3(d))。細胞-細胞相互作用的數(shù)量在打印后分化組別中最高。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]波形蛋白是一種主要的結構性中間纖維蛋白，在正常的 CSK 中低水平表達。在 IF 染色的打印前和打印后分化方法中，hASC-CSK 均檢測到波形蛋白的低表達(圖3(d)) ，而 hASC 中沒有表達。與生物3D打印的 hASC 相比，打印前分化的 hASC-CSK 檢測到 VIM 表達增加(p < 0.05)。相反，在 IF 染色中，hASC 顯示 α-SMA 的陽性表達，而在打印前和打印后分化的 hASC-CSK 中很少或沒有表達 α-SMA。Lumican 是富含亮氨酸的小蛋白多糖家族的成員，也是角膜基質中發(fā)現(xiàn)的主要 KS 蛋白多糖。在這里通過共聚焦最大密度投影圖像(圖3(e))和具有纖維組織和密度的組織切片的 IF 染色(圖3(f))顯示的打印前分化策略中，在用 hASC-CSK 制備的打印結構中檢測到最高的 lumican 表達。在 qPCR 分析中，與2D中的未分化 hASC (p < 0.001)和3D 打印的 hASC (p < 0.01)(圖3(g)) 相比，打印前和打印后分化的方法均顯示 LUM 表達增加。然而，與作為陽性對照的 hCSK 相比，hASC-CSK 中 LUM 和 VIM 的表達較低(p < 0.001)。這些數(shù)據(jù)表明，這兩種打印策略已經使結構中的 hASC 向角膜角質細胞譜系的分化開啟。在打印14天后的打印結構照片(圖3(h))中可以檢測到帶有 hASC 的打印結構的不透明度增加。相比之下，用打印前和打印后分化的方法所構建的樣品顯示出透明的結構。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]圖3. 人眼角膜基質結構的生物3D打印方案。(a)打印 hASC 21天后冷凍切片的 HE 染色，打印前分化的 hASC-CSK 和打印后分化的 hASC-CSK。比例尺500微米。(b)細胞分布，形態(tài)和取向。比例尺200微米。(c)波形蛋白(紫色) ，Cx43(綠色)和 α-SMA (紅色)(d)和 lumican (紅色)(e)的共焦最大密度投影。比例尺100微米。(f)在打印21天后從冷凍切片顯現(xiàn)的 Lumican (紫色)表達。比例尺200微米。(g) LUM 和 VIM 的 qPCR 分析(* = p < 0.05，* * = p < 0.001)。hCSK 作為對照。培養(yǎng)14d 后生物3D打印角膜基質結構的透明度(h)。用 Hoeschst 33342(藍色)顯示細胞核。

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生物3D打印角膜基質結構與宿主組織的整合

在探索了用 HA-DA 生物墨水生物3D打印人類角膜基質的可能性之后，研究接下來評估了打印的角膜基質結構體植入體內角膜缺損模型后的性能。根據(jù)前述實驗結果，選擇了打印前分化的構建策略。研究對切除角膜的豬進行了前板層角膜移植手術，將生物3D打印的角膜基質移植到傷口部位。培養(yǎng)21天后，采用 HE 染色和 IF 染色，觀察打印結構與宿主角膜的整合情況。植入的生物3D打印角膜基質結構在培養(yǎng)期間沒有額外固定的情況下可以保持在原位。21天后，生物3D打印的角膜基質結構顯示出與宿主角膜良好的附著和粘附(圖4(c))。IF 染色顯示打印結構中含有STEM121陽性細胞，即打印結構中仍然存在人類細胞。高倍圖像(圖4(g))表明，打印結構是緊密連接到基礎宿主基質。此外，當檢查植入結構和宿主角膜的界面(圖4(h))時，在打印結構內觀察到 STEM121陰性的細胞，表明豬細胞遷移到打印結構。此外，在頂端一側，宿主豬上皮已經在生物3D打印的角膜結構上生長(圖4(i))。豬角膜上皮覆蓋了 STEM121陽性的含有打印基質結構的人類細胞(圖4(j))。最后，在離體培養(yǎng)物的打印結構中也檢測到 lumican 的少量表達(圖4(k))。

圖4. 在豬體內培養(yǎng)21天后的生物3D打印角膜基質結構。(a)將生物3D打印結構植入 Barron 人工前房中，(b)植入生物3D打印仿生基質結構的豬眼球，(c)生物3D打印角膜基質仿生結構的體內培養(yǎng)后的 HE 染色，(d)中央人類角膜基質，比例尺200μm，(e)用人細胞特異性標記 STEM121(綠色)和鬼筆環(huán)肽(紅色)分析生物3D打印的角膜基質與宿主整合的情況。(f)將人角膜基質作為對照。比例尺500微米。(g)來自 HE 和(H) IF 染色的生物3D打印結構與素質豬基質之間界面的高倍放大圖像。STEM121(綠色)陰性的細胞出現(xiàn)在打印結構中(白色 *) ，表明宿主細胞與打印的基質結構整合。(i) HE 染色和(j) IF 染色的生物3D打印表層結構的高倍圖像。(k)體內培養(yǎng)的生物3D打印結構中角膜基質標記物 Lumican (紅色)的表達。(1)以人眼角膜為對照。比例尺100μm ((g)-(l))的細胞核用 Hoechst 33342(藍色)顯示。

生物3D打印角膜基質的神經長入和支配

采用 LIVE/DEAD 方法研究了hPSC-神經元與 HA-DA 生物墨水的細胞相容性。神經元表現(xiàn)出良好的生存能力。大多數(shù)細胞在打印1天后仍然存活，并且在打印7天后觀察到死亡細胞的數(shù)量減少(圖5(a))。水凝膠中的細胞表達神經元標志物 βIII-tube 和 MAP。打印1天后，神經元顯示出短的神經突生長，并且在打印7天后形成長軸突的清晰的神經元網絡(圖5(b))。在兩個時間點均檢測到細胞增殖標記物的暴打(Ki67陽性)，但7天后陽性細胞的數(shù)量減少(圖5(c))。上述發(fā)現(xiàn)表明 HA-DA 生物墨水與 hPSC 來源的神經元細胞具有良好的細胞相容性。通過將神經元細胞打印到結構的外圍，成功地將神經支配加入到生物3D打印的基質仿生結構中(圖5(d))。對于沒有靶細胞的對照組(圖5(d) i)或以 hASC-CSK 作為靶細胞的打印結構(圖5(d) ii) ，研究打印基質仿生結構的神經支配發(fā)展。無靶細胞的樣品培養(yǎng)21天，以 hASC-CSK 為靶細胞的樣品培養(yǎng)14天。在兩組中，隨著時間的推移都檢測到向中央角膜方向的長突生長(圖5(e)和(f))。然而，在以 hASC-CSK 為靶細胞的樣品中，神經支配似乎發(fā)展得更快、更早。培養(yǎng)7天后的含 hASC-CSK 的3D 角膜結構的中心部分已經可以看到表達 NFH 的長軸突，而在對照組中，直到培養(yǎng)14天，在沒有靶細胞的生物墨水中不能看到軸突。對照組培養(yǎng)21天后軸突生長情況與對照組相似。在共培養(yǎng)組中，在 hASC-CSK 之間生長的軸突在打印14天后形成了幾個軸突的束(圖5(f))。

圖5.受神經支配的生物3D打印角膜基質仿生結構。(a)生物墨水中的神經細胞在打印一天和七天后的活性(活細胞 = 綠色，死細胞 = 紅色)。(b)打印后1天和7天，在打印行中細胞的神經元標志物 βIII 桶(紅色)和 MAP2(綠色)的表達。(c)增殖標記 Ki67(洋紅色)在打印行后1天和7天的陽性染色。(d).實驗組的示意圖: 生物3D打印角膜基質仿生結構，其中神經元細胞被生物打印到角膜的外圍(位置突出顯示紫色方塊)。中央部分為(i) 沒有細胞的生物墨水 (對照)或(ii)含hASC-CSK的生物墨水(位置突出顯示在黃色方塊)。在對照組和以 hASC-CSKs 作為神經元中心靶細胞組別中觀察隨時間發(fā)展的神經支配表達物(e) NFH (綠色)和(f)鬼筆環(huán)肽(洋紅色)的 hASC-CSKs 染色。比例尺為100微米。

結論和展望

研究開發(fā)了一種基于 HA 的生物墨水，使用動態(tài)共價化學，以滿足下一代生物墨水的要求，具有優(yōu)異的打印適性，穩(wěn)定性，細胞相容性以及打印后不使用光交聯(lián)的優(yōu)點。HA-DA 生物墨水具有良好的力學性能和自愈合性能。同時研究證明了開發(fā)的生物墨水使用臨床潛在的人類干細胞完成人類角膜基質仿生結構生物3D打印的可行性。生物3D打印的角膜基質仿生結構能夠良好的與宿主組織整合。研究制造了第一個具有神經支配的生物3D打印角膜組織模型，證明了開發(fā)的生物墨水和打印的人類干細胞來源的角膜基質仿生結構在未來的各種角膜組織工程應用中具有巨大的潛力。

參考文獻

Mörö A, Samanta S, Honkamäki L, et al. Hyaluronic acid based next generation bioink for 3D bioprinting of human stem cell derived corneal stromal model with innervation[J]. Biofabrication, 2022, 15(1): 015020.

https://doi.org/10.1126/10.1088/1758-5090/acab34

參考文獻

[color=rgba(0,]https://doi.org/10.1126/10.1088/1758-5090/acab34