《Advanced Science》：生物3D打印功能化氣管重建

來源： EngineeringForLife
本論文第一作者：霍瑩瑩、徐勇、吳曉娣；
通訊作者：華宇杰、Y. Shrike Zhang、周廣東。該工作材料學部分得到了上海交大朱麟勇教授團隊的大力支持。  


功能化氣管重建一直是臨床上面臨的重大挑戰(zhàn)，其關鍵技術難點在于缺乏理想的氣管移植物。組織工程技術為構建功能化氣管移植物提供了一種可行的策略。目前，利用組織工程管狀軟骨實現的氣管再生已初步得到驗證，但是管狀氣管軟骨結構不可避免會造成運動過程中的局部機械應力集中，同時也缺乏構建分布在軟骨結構之間的血管化纖維結締組織和管腔內壁上皮組織。眾所周知，天然氣管是具有交替分布的軟骨環(huán)（C環(huán)）和血管化纖維環(huán)（VF環(huán)），以及氣道內壁上皮化構成的管狀異質組織結構，這種異質組織結構對于實現氣管的力學和生理功能重建至關重要。

近期，上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院、上海市組織工程重點實驗室、組織工程國家工程研究中心周廣東團隊，聯合哈佛醫(yī)學院Y. Shrike Zhang教授，設計并開發(fā)了一種組織特異性光交聯生物墨水，并應用生物3D打印技術構建軟骨-血管化纖維組織交替結構的仿生氣管（CVFIT）。如圖1所示，C環(huán)和VF環(huán)交替設計的管狀結構可以精準模擬天然氣管的生理結構與功能。其中，C環(huán)是由軟骨細胞負載的軟骨特異性光交聯生物墨水（p-CB）構成；VF環(huán)是由成纖維細胞負載的纖維組織特異性光交聯生物墨水（p-VFB）構成；并通過酰胺化反應實現C環(huán)與VF環(huán)之間的一體化化學鍵鍵合。生物3D打印的CVFIT不僅能夠在體內實現軟骨-血管化纖維組織一體化的氣管再生，而且能夠實現節(jié)段性氣管缺損修復。相關研究論文：“Functional Trachea Reconstruction Using 3D-Bioprinted Native-like Tissue Architecture Based on Designable Tissue-specific Bioinks”發(fā)表于Advanced Science上。

圖1 組織特異性生物墨水構建及功能化氣管重建示意圖

1. 組織特異性生物墨水制備與表征
為了構建適合軟骨和纖維組織再生的生物墨水，研究者選擇軟骨組織來源的脫細胞細基質制備光交聯軟骨脫細胞基質（ACMMA）水凝膠，并添加甲基丙烯�；�明膠（GelMA）和甲基丙烯�；�硫酸軟骨素（CSMA）構成軟骨特異性光交聯生物墨水；選擇真皮組織來源的脫細胞細基質制備光交聯真皮脫細胞基質（ADMMA）水凝膠，并添加甲基丙烯�；�透明質酸（HAMA）和八臂琥珀酸酯化聚乙二醇（8-PEG-NHS）構成血管化纖維組織特異性光交聯生物墨水。兩種組織特異性光交聯生物墨水均可通過光引發(fā)自由基聚合反應實現快速交聯和有效增強力學強度，而8-PEG-NHS介導的兩相界面酰胺化反應能夠顯著加強相鄰環(huán)之間的界面整合。熒光染色和原子力顯微鏡（AFM）圖像證實了界面的無縫融合；X射線光電子能譜（XPS）證實了基于酰胺化反應的界面化學鍵整合。進一步，力學有限元分析結果顯示，軟-硬交替管狀結構具有縱向拉伸性和側向彎曲能力，而單一硬度管狀結構在側向彎曲時會導致局部區(qū)域機械應力集中，同時也缺乏縱向拉伸性（如圖2所示）。

圖2 組織特異性生物墨水及界面整合表征

2. 仿生氣管打印構建與表征
首先，研究者證實溫敏性p-CB生物墨水和高粘度p-VFB生物墨水是兩種擠出式生物3D打印的可行策略。接著，研究者利用p-CB和p-VFB生物墨水，通過雙噴頭生物3D打印技術，構建出具有交替管狀結構的氣管類似物，然后在紫外（365 nm, 20 mW/cm²）光照下進行交聯成型，以增強力學強度并維持三維形態(tài)。在多細胞生物3D打印中，熒光標記的軟骨細胞（綠色）和成纖維細胞（紅色）呈現交替分布于管狀結構中，從而證實結合組織特異性生物墨水的生物3D打印技術能夠實現多種細胞的精準定位和異質結構構建。（如圖3所示）

圖3 生物墨水可打印性評價和生物3D打印仿生氣管表征

3. 體內氣管再生與功能評價
研究者將生物3D打印CVFIT植入裸鼠皮下，并系統(tǒng)進行了大體觀、力學性能、組織學染色、定量檢測評價。實驗結果表明，皮下植入8周后，實驗組CVFIT成功再生了軟骨-血管化纖維組織交替結構的仿生氣管，而對照組僅為單一軟骨管狀結構。由于軟-硬交替分布的組織結構，再生的仿生氣管表現出優(yōu)異的抗壓性、縱向拉伸性和側向彎曲能力；而再生的軟骨管，由于再生軟骨僅僅呈現單一硬度結構，使得缺乏縱向拉伸性，在側向應力加載下存在明顯的結構缺陷，這不可避免會對運動（如抬頭、低頭、頸部側向彎曲等）過程中氣管通氣順暢產生不利影響。組織學結果進一步證實，再生的仿生氣管呈現與天然氣管類似的軟骨-血管化纖維組織交替結構以及組織特異性ECM沉積，這一仿生結構設計保證了軟骨環(huán)可以從鄰近的血管化纖維環(huán)中獲取足夠的營養(yǎng)供應�？傊�，軟-硬交替組織結構的再生氣管不僅有利于力學功能重建（抗壓、拉伸和彎曲能力），而且有利于氣管生理學功能重建。（如圖4所示）

圖4 體內氣管再生與功能重建評價

4. 節(jié)段性氣管缺損修復評價
為了進一步驗證仿生氣管實現原位功能重建的可行性，研究者首先將生物3D打印的CVFIT經體內皮下植入預培養(yǎng)8周，然后將再生氣管連同血管蒂進行端到端吻合術，修復兔節(jié)段性氣管缺損（15 mm長）。術后8周，再生氣管呈現完整連續(xù)的管腔結構，內表面光滑，無痰液堆積，并且與天然氣管實現一體化整合。組織學結果表明，生物3D打印的仿生氣管可以實現與天然氣管類似的軟骨-血管化纖維交替結構的組織再生和上皮化功能重建。（如圖5所示）

圖5 節(jié)段性氣管缺損重建修復評價

文章來源：
http://doi.org/10.1002/advs.202202181