中山大學郭雙壯等《Adv.Sci.》:冰與光之歌，冷凍打印+激光融化實現(xiàn)大尺寸細胞凍存！

來源： 高分子科學前沿

干細胞療法可以為癌癥、帕金森病、受損脊柱神經(jīng)、糖尿病等諸多疾病的治療帶來革命性的改變，但其中關鍵的一步是細胞制品的高通量冷凍保存，并在使用前快速高效復蘇。而傳統(tǒng)較慢的冷凍方法會引起細胞內(nèi)外水的結(jié)晶，從而對細胞器和遺傳物質(zhì)帶來無法修復的損傷。這就需要添加較多的冷凍保護劑（CPA）或保存小尺寸的樣品來提高細胞存活率。同時，傳統(tǒng)的水浴復蘇法在處理大尺寸干細胞凍存樣品時也會因傳熱緩慢而損傷細胞。因此，如何高通量、高存活率地凍存和復蘇干細胞成為制約相關制品應用的瓶頸之一。

中山大學的郭雙壯副教授和美國明尼蘇達大學John Bischof教授團隊合作，開發(fā)了液氮溫度下的大液滴冷凍打印技術和激光引發(fā)的等離體激元加熱融化技術，并分別應用于大尺寸干細胞樣品的凍存和復蘇，整個過程細胞存活率高達90%以上。該研究內(nèi)容以 "Conduction Cooling and Plasmonic Heating Dramatically Increase Droplet Vitrification Volumes for Cell Cryopreservation" 為題發(fā)表在《Advanced Science》上。

圖 1. 大液滴玻璃化冷凍打印和激光解凍示意圖

大尺寸液滴冷凍打印
計算機控制的3D打印墨水分配系統(tǒng)，可以通過調(diào)節(jié)壓力和時間很靈活地控制液滴的大小和位置，為自動化高通量冷凍保存提供了支持。液滴冷凍打印的目標是使液滴盡可能快速地從室溫冷卻到零下140 ℃以下，水分子來不及結(jié)晶而以玻璃態(tài)保存，這就需要在CPA盡量少用的情況下提高液氮和液滴之間的熱量傳遞速度。直接將液滴打印到液氮中會因為氮氣的包裹浮在液面，同時氮氣層也阻礙了液滴中熱量的傳遞，降低了冷卻速度而使水結(jié)晶成冰。

作者采用浮在液氮表面的銅箔作為載體，在液氮沸點溫度（-196 ℃）附近的環(huán)境中將液滴打印在銅箔表面（如圖1所示）。這種方法一方面使得液滴以較大接觸面與銅箔以熱傳導方式發(fā)生快速熱量交換，同時表面與超冷空氣以自然對流方式傳熱，二者共同作用下液滴的冷卻速率高達 104 ℃/min （如圖2所示）。 隨著液滴體積的變大，頂部冷卻速率迅速下降，同時內(nèi)部熱應力的積累還會導致液滴的破碎，綜合CPA濃度和冷卻速度等因素的影響，4微升液滴具有較為平衡的玻璃化能力。

圖 2. 液滴冷卻速率表征。A-C）在打印液滴的頂部、中部和底部放置熱電偶用于測量溫度實時變化（比例尺=1 mm）。D） 不同位置的溫度變化曲線。E）不同位置平均冷卻速率。

激光等離體激元加熱
除了快速冷凍，加熱復蘇也是細胞制品凍存過程的重要環(huán)節(jié)，而傳統(tǒng)水浴復蘇法是一種對流熱傳遞過程，在升溫后期會存在明顯的去玻璃化現(xiàn)象，同時隨著液滴體積的增大，內(nèi)部升溫速率會迅速減小到103 ℃/min。本研究中，在CPA溶液加入生物相容性良好的金納米棒（GNR），在波長為1064 nm激光作用下通過等離子體激元效應將光能轉(zhuǎn)化為熱能，再將熱能迅速傳遞到周圍處于玻璃態(tài)的液滴并使其融化（如圖3所示）。

通過精確調(diào)節(jié)GNR濃度、激光強度和脈沖時間，可以避免液滴在加熱過程中出現(xiàn)過冷或過熱現(xiàn)象對細胞的損害。這樣通過無數(shù)納米顆粒多點加熱的方式可以使得凍存的玻璃態(tài)液滴以高達 106 ℃/min的升溫速率被復蘇。同時隨著液滴體積的增大，由于透鏡折射作用而引發(fā)的分層現(xiàn)象更加明顯（圖3G）。外層液滴無法經(jīng)激光直接加熱，需要經(jīng)內(nèi)部液滴熱傳導加熱而融化，從而形成一個較冷的外殼。對于超過16 微升的液滴來說，由于外殼較厚會發(fā)生重新結(jié)冰現(xiàn)象，對細胞的存活產(chǎn)生較大影響。經(jīng)過系列過程參數(shù)優(yōu)化，含有干細胞的4微升液滴經(jīng)過冷凍打印-激光復蘇整個流程處理之后，干細胞的存活率可達90.4%。冷凍的液滴在液氮中保存三個月再重新經(jīng)激光復蘇，細胞存活率沒有明顯下降。

綜上所述，作者及研究團隊將冷凍打印和激光加熱相結(jié)合，可以獲得超高的冷卻和升溫速率，從而實現(xiàn)大液滴（4微升）、低CPA濃度、高存活率地凍存干細胞。整個過程都可以進一步由自動化程序控制，從而為高通量、高效率凍存生物制品提供了一條可靠的技術路徑。未來該技術可適用于其他細胞類型，為血液病、癌癥患者等需要進行細胞治療的人群帶來福音。

圖 3. 玻璃化液滴加熱復蘇過程表征。A）高速相機記錄的激光加熱過程。B）傳統(tǒng)水浴加熱過程。C）等離子激元加熱原理示意圖。D-E）GNR濃度對溫度非均一性、能量吸收率的影響。F）不同液滴大小和GNR濃度與能量吸收率之間的關系。G）不同大小液滴在激光加熱過程中的照片和升溫速率分布模擬結(jié)果。H）不同液滴大小在激光加熱和水浴加熱過程中的升溫速率變化。I）不同液滴內(nèi)部超過臨界升溫速率體積分布。比例尺=1 mm。

占利博士和郭雙壯副教授為該論文的第一作者，John Bischof教授為該論文的通訊作者。

原文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202004605