伊利諾伊大學：無顆粒3D打印導電水凝膠可神經(jīng)元生長和電生理記錄

來源：高分子材料科學

最近，伊利諾伊大學香檳分校Chen Wang博士/Ralph G. Nuzzo教授團隊在《Advanced Functional Materials》上發(fā)表了題為3D ParticleFree Printing of Biocompatible Conductive Hydrogel Platforms for Neuron Growth and Electrophysiological Recording論文。他們論述了導電3D周期微支架是使用無顆粒直接墨水書寫方法制造的，用作神經(jīng)元生長和電生理記錄平臺。聚（甲基丙烯酸2-羥乙酯）/吡咯油墨，然后進行吡咯的化學原位聚合，可以通過小至1 m的噴嘴進行水凝膠打印。這些導電水凝膠可對復雜的2D和3D結構進行圖案化，并與測試細胞培養(yǎng)物具有良好的生物相容性（7天后的活力約為94.5％）。水凝膠陣列促進廣泛培養(yǎng)的加州Ap腳踏板神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的神經(jīng)突生長。該平臺允許細胞外電生理記錄穩(wěn)態(tài)和刺激的電神經(jīng)元活動�？偠�言之，這種3D導電油墨打印工藝能夠制備生物相容性和微米級的結構，以創(chuàng)建定制的體外電生理記錄平臺。

導電水凝膠的打印和表征
設計用于直接墨水書寫的新墨水，使其能夠制造具有細胞大小尺度特征尺寸的電生理凝膠平臺。這種可打印材料由乙醇水溶液中各種分子量的pHEMA鏈與吡咯共聚單體的物理纏結聚合物網(wǎng)絡組成。圖1示意性地說明了這種成分和制造順序，以獲得導電凝膠支架。對pHEMA均聚物的含量進行了優(yōu)化，以滿足直接墨水書寫的流變要求和適用于細胞培養(yǎng)研究的功能性凝膠復合材料的要求。聚合物網(wǎng)絡設計在打印過程中將吡咯單體限制在水凝膠基質中，隨后用氯化鐵進行處理會引起原位聚合并摻雜生成的互穿聚吡咯。在處理后數(shù)分鐘內(nèi)，打印的水凝膠從無色透明變?yōu)樯詈谏�，可見聚合和摻雜。充分漂洗打印的圖案，然后每4小時浸入去離子水中，每4小時進行4次水交換，以除去未反應的單體。由于這種微細加工工藝使油墨打印與原位導電顆粒形成分離，因此可以獲得微米級的特征寬度。導電細絲的輕松，無堵塞擠壓可實現(xiàn)復雜的3D結構形成（如圖2所示）。

圖1 不含導電顆粒的水凝膠的形成示意圖。頂行表示打印結構的宏觀視圖，而底行表示水凝膠形成三個階段的精細結構。下排圖片中的綠線表示聚HEMA鏈，黃色三角形表示吡咯單體，棕點表示吡咯低聚物，黑點表示聚吡咯顆粒。

圖2 水凝膠油墨的特性包括其流變行為和形成穩(wěn)定結構的能力。a）墨水存儲模量（G'）和損耗模量（G''）在1Hz頻率下以振蕩模式在1Hz下測量，顯示出墨水具有類似液體的響應。b）測得的油墨粘度是剪切速率的函數(shù)，并顯示了3D打印所需的剪切稀化特性，黑線顯示了剪切稀化指數(shù)。c）使用1 m尖端打印的圖案的透射光光學顯微鏡圖像證明了使用小噴嘴進行可行的打印。d）打印的3D金字塔結構圖像顯示墨水具有出色的3D可構建性，單絲用箭頭標記。

流變性質是影響3D微結構打印的重要因素。此處，油墨的流變功能和打印結構的示例如圖2所示。在流變學表征期間，水凝膠油墨處于水合狀態(tài)，使用水和乙醇的溶劑阱來防止測量過程中的蒸發(fā)。優(yōu)化了pHEMA-吡咯水凝膠油墨的彈性模量和粘滯模量，使油墨絲能夠跨越底層的縫隙，同時保持其形狀。

由打印的絲狀（脫水）結構制成的SEM分析（圖3a，b）揭示了固化步驟形成的PPy的一般形態(tài)特征；這些顯微照片揭示了一個緊密滲透的納米顆粒網(wǎng)絡（圖3c，d）。pHEMA絲狀網(wǎng)絡形成了更加分散的基質，該基質在物理上限制了復合材料水合狀態(tài)下的這種密集的納米粒子種群。從結構的高放大倍數(shù)俯視圖判斷（圖3c），與純pHEMA薄膜和打印結構形成的邊界相比，這些納米粒子使復合材料的表面明顯更粗糙。細絲結構的高分辨率橫截面SEM圖像表明，在細絲的整個內(nèi)部域中都存在直徑≈100nm的PPy納米顆粒（圖3d）。

圖3 印出的“ I”圖案的宏觀和SEM圖像包括：a）印出的圖案具有1 mm比例尺的照片，b）從（a ）用400 m的比例尺，c）用100 nm的比例尺放大（b）中描繪的單條打印線的突出顯示區(qū)域的圖像，以及d）導電水凝膠圖案的橫截面的SEM圖像，其中 500 nm比例尺。

將使用電化學工作站測量的復合水凝膠的電導率與四點探針測量的結果進行比較（圖4a）。通過在PBS緩沖液中對Ag/AgCl進行多次CV掃描來探索水凝膠的電化學穩(wěn)定性，如圖4b所示。復合水凝膠的電容行為和法拉第電流有助于提高電荷轉移效率，并最終在設備/電池界面記錄信號質量。作者還從宏觀角度評估了材料作為電導體的性能（圖4c，d）。在此，將復合水凝膠絲網(wǎng)打印并插入具有4.5 V LED光源和電源的電路中。該演示表明，當由5V DC施加的偏壓供電時，打印的圖案可以支持LED的發(fā)射。

圖4 導電水凝膠油墨的電和電化學特性。a）導電水凝膠薄膜的阻抗幅度隨頻率變化的I-V曲線和波特圖顯示出固有電導率為13.59 S cm-1，歸一化阻抗為8.4Ωcm2。b）PBS緩沖液中的導電水凝膠薄膜相對于Ag/AgCl的CV掃描結果（20個循環(huán)，掃描速度20 mV s-1）顯示聚吡咯的還原和氧化。c，d）當連接到以打印的水凝膠網(wǎng)作為導體并施加5V電壓的電路中時，LED點亮。響應于所提供的功率，LED的照明和變暗證明了水凝膠網(wǎng)的導電性。

評價復合水凝膠的生物相容性
pHEMA和PPy都沒有細胞毒性的報道，已被廣泛用作各種生物分析應用中的活性和輔助材料。這里展示的是新復合材料的直接生物相容性測試結果，表明該材料可用作基底以支持培養(yǎng)中細胞正常生長的模式，甚至促進有用形式的細胞從玻璃基底遷移并附著在打印導電絲上。在這些實驗中（圖5），將設備滅菌后，將MC-3T3-E1前成骨細胞接種到帶有打印U型復合細絲的導電水凝膠薄膜或載玻片上（圖5a-d），如實驗中所述部分。在7天的培養(yǎng)期內(nèi)，使用活/死分析評估了薄膜支持的培養(yǎng)物上的細胞活力，并在第1、3和7天對死（紅色）和活（綠色）細胞進行計數(shù)（圖5b，e） 。

圖5 導電水凝膠的生物相容性評估顯示出高存活率并促進細胞遷移。a）在水凝膠薄膜上進行的細胞培養(yǎng)實驗方案，其中b）在導電水凝膠薄膜上培養(yǎng)7天并用活/死分析法染色的成骨細胞的熒光圖像�；罴毎�呈現(xiàn)綠色，呈死紅色。c）培養(yǎng)的細胞遷移到打印出的U形導電圖案上的方案，其中d）培養(yǎng)7天后細胞遷移到打印的細絲上的熒光圖像，箭頭表示遷移方向。e）在第1、3和7天，水凝膠薄膜上的成骨細胞的存活率。f）導電水凝膠的表面電荷測量，以及在無聚吡咯的pHEMA水凝膠（黑色）和導電水凝膠（紅色）的PBS緩沖液中的參比。

用于單個培養(yǎng)的神經(jīng)元電生理記錄的基于導電墨水的平臺
墨水的電導率和生物相容性允許制造電生理記錄平臺，用于研究培養(yǎng)的神經(jīng)元的電活動（圖6a）。圖6b描述了在記錄之前單元與打印陣列的兩種類型的交互。這些代表性的數(shù)據(jù)顯示了優(yōu)選與陣列的復合水凝膠材料進行最大程度接觸的細胞相互作用的行為：較小的細胞傾向于以陣列細絲的頂部為中心，而較大的細胞更常見地跨越兩個相鄰的陣列細絲。像成骨細胞一樣，培養(yǎng)基中存在的帶正電的表面也不會抑制細胞附著，因此不需要額外的表面處理。圖6c顯示了從記錄和刺激組及其相應的控制設備獲取的電生理記錄。與之形成鮮明對比的是，來自記錄和刺激組的信號顯示了動作電位，具有來自記錄和刺激實驗的代表性單個尖峰（圖6d）。神經(jīng)元與陣列的長期相互作用（圖6e）突出顯示了導電水凝膠的生物相容性，在培養(yǎng)5天后，神經(jīng)元沿陣列的細絲大量向外生長。

總結
作者已經(jīng)開發(fā)并成功測試了具有出色生物相容性和高空間分辨率的3D可打印導電水凝膠油墨。微周期導電陣列已被制造并用作神經(jīng)元細胞外信號記錄平臺。證明了這種陣列有助于在穩(wěn)態(tài)和刺激狀態(tài)下檢測神經(jīng)元活動的能力。這種可編程的導電水凝膠為制造高空間分辨率的平臺提供了新的機會，該平臺可以幫助研究包括神經(jīng)元在內(nèi)的不同電活性細胞的體外和體內(nèi)活性。