北京協(xié)和醫(yī)院等機構3D打印肝臟！延長肝衰竭小鼠模型的存活時間

來源：BioArt生物藝術

臟移植是治療各種終末期肝病的唯一方法。然而供體肝臟的短缺一直是臨床上限制肝移植的最主要因素。近年來，3D生物打印技術在醫(yī)學領域的發(fā)展非常迅速，比如神經外科，頜面外科等。該技術在肝臟移植領域也頻有捷報傳來。最早在2013年，科學家首次報道了利用3D打印技術將3例捐獻者及患者的肝臟制成3D模型，用以指導接下來的移植策略。同年，有公司成功打印出深500 μm的肝臟組織，能正常存活40天，并且在體外具有普通肝臟的功能，后續(xù)該公司也打印出了具有生物活性的完整的迷你肝臟。但3D打印的肝臟組織能否在體內發(fā)揮功能尚不清楚。2015年，北京協(xié)和醫(yī)院毛一雷教授成功在該領域取得突破并在當年舉行的十五屆全國肝癌學術會議作了報告，其研究團隊成功在3D打印細胞結構中實現了膽管網廣泛分布，提高了三維結構的物質交換能力，最終得到了體外能長期存活的具有藥物代謝功能的人體類肝組織。

近日，來自北京協(xié)和醫(yī)院的毛一雷教授、清華大學孫偉教授以及上海科技大學黃鵬羽教授的研究團隊在GUT雜志在線發(fā)表了題為Three-dimensional bioprinted hepatorganoids prolong survival of mice with liver failure的文章，該研究以肝細胞和生物墨水為原料，采用特定的3D打印程序，打印出了肝臟類器官（3D bioprinted hepatorganoid，3DP-HO）。該3D打印類肝器官不僅在體外具有良好的肝臟特征，將其移植到I型酪氨酸血癥肝衰竭模型小鼠體內，也能顯著改善小鼠的肝功能，并提高小鼠的存活率。這不僅為開發(fā)針對肝臟疾病的新型療法提供了新的工具，更展示了3D生物打印類器官的體內活性和該技術在肝臟移植領域的應用潛能。

作者首先探索了用于打印肝臟類器官的原料以及誘導分化的條件。作者在前期實驗中對比了原代肝細胞、胎肝細胞以及多種肝細胞系。但原代肝細胞在3D打印過程中死亡率過高，而胎肝細胞和HepG2細胞（一種肝癌細胞系）的肝臟功能較差。綜合考慮對3D打印的耐受性和肝功能之后，作者采用了HepaRG細胞（一種人肝祖細胞）進行后續(xù)的3D生物打印。生物墨水（用于粘合細胞的生物材料）的選擇在3D生物打印過程中也非常關鍵。明膠和藻酸鹽在用氯化鈣處理后具有良好的生物屬性，可以用作生物墨水。研究人員系統(tǒng)測試了不同比例的明膠和藻酸鹽，最終選擇了5％明膠和1％海藻酸鹽用作生物墨水組合。此外，溫度也是影響3D生物打印成功率的關鍵因素。研究人員經對比測試后，采用在噴嘴中保持20℃，在成形空間中保持10℃來打印3DP-HO。

為了促進3DP-HO中HepaRG細胞向肝細胞分化和成熟，作者先將3DP-HO在體外培養(yǎng)3天，然后通過0.5％DMSO處理7天誘導肝向分化。結果表明3DP-HO中HepaRG細胞可以在體外分化為白蛋白陽性的肝細胞(82.5%±4.6%)。經體外誘導肝向分化后的3DP-HO也表達了大量的肝臟特異性基因，并具有了積累肝糖原、轉運吲哚綠和乙�；�的低密度脂蛋白的能力。非常重要的是，3DP-HO也具有良好的肝臟解毒功能。與2D培養(yǎng)的HepaRG細胞，以及傳統(tǒng)的3D培養(yǎng)的HepaRG細胞相比，3DP-HO無論在肝臟基因表達還是功能上都更具優(yōu)勢。這些結果表明3DP-HOs在體外誘導肝向分化后表達了肝臟基因，并獲得了一些關鍵的肝臟功能。

研究人員隨后將體外誘導肝向分化的3DP-HO移植到了免疫缺陷的I型酪氨酸血癥肝衰竭模型小鼠體內，這也是這項研究的一個重要的亮點。在接受3DP-HO移植后第4周，小鼠血清丙氨酸氨基轉移酶、總膽紅素、直接膽紅素、谷氨酰轉肽酶和堿性磷酸酶水平顯著降低，說明3DP-HO移植緩解了肝臟損傷。移植小鼠血清中酪氨酸等相關氨基酸水平也顯著下降，說明3DP-HO對I型酪氨酸血癥小鼠的酪氨酸代謝缺陷有明顯的治療效果。

在移植小鼠的血清中，研究人員也檢測到了大量人員的白蛋白、抗胰蛋白酶、凝血因子VII和凝血因子IX。尤其是，研究人員發(fā)現移植3DP-HO的小鼠獲得了人肝細胞特異的代謝異哇胍（debrisoquine）的能力。這說明3DP-HO確實在移植小鼠體內發(fā)揮了肝臟的功能。此外，移植3DP-HOs也改善了小鼠原生肝臟的壞死現象。最重要的是，移植3DP-HO的肝衰竭小鼠存活時間顯著延長，并且移植后的3DP-HO中形成了新的血管網絡。

總而言之，研究人員使用了HepaRG肝祖細胞通過3D生物打印技術來構建肝臟類器官。該類器官在體外和體內均表現出良好的肝臟功能，并且在移植后能夠延長肝衰竭小鼠的生存期。盡管這項研究距離臨床應用還很遠，但是這一開創(chuàng)性研究展示了3D生物打印技術在肝移植治療中的潛在價值。相信不遠的將來，科學家可以利用生物3D打印技術打印出可供移植的人類肝臟，而這將造福萬千肝病患者。