梳狀輔助3D生物打印提升晚期肌生成基因表達

來源：EFL生物3D打印與生物制造

在組織再生領(lǐng)域，機械轉(zhuǎn)導(dǎo)對細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)通訊至關(guān)重要，但傳統(tǒng)3D生物打印技術(shù)在使用低粘度生物墨水時，常因無法產(chǎn)生足夠剪切應(yīng)力，導(dǎo)致細(xì)胞刺激不足，影響組織形成與功能。來自成均館大學(xué)的GeunHyung Kim教授團隊合作開發(fā)梳狀輔助生物打印技術(shù)，通過在打印噴嘴附加梳狀微結(jié)構(gòu)，增加生物墨水上的剪切應(yīng)力，優(yōu)化梳齒間隙和噴嘴移動速度等參數(shù)，實現(xiàn)對生物墨水的機械刺激，促進細(xì)胞排列及機械敏感基因表達，改善肌管形成與肌球蛋白重鏈排列，提升晚期肌生成相關(guān)基因表達。相關(guān)工作以“Comb-assisted 3D bioprinting for highly aligned 3D muscle bioconstructs with enhanced cellular mechanotransduction”為題發(fā)表在《Virtual and Physical Prototyping》上。

研究內(nèi)容
通過構(gòu)建包含重力、剪切力和毛細(xì)力的多力作用模型，結(jié)合3D模型與光學(xué)圖像，研究了梳狀結(jié)構(gòu)對生物墨水流向的影響。結(jié)果表明，梳狀結(jié)構(gòu)能有效誘導(dǎo)膠原蛋白分子沿打印方向排列，與普通打印相比，其 alignment 程度顯著提升。

圖 1. 梳狀輔助生物打印過程示意圖

采用不同梳齒間隙（300-600μm）的梳狀結(jié)構(gòu)進行生物打印，通過活/死細(xì)胞染色、免疫熒光和F-actin染色，研究了間隙大小對細(xì)胞 viability、Piezo1 表達和細(xì)胞骨架排列的影響。結(jié)果表明，400μm 梳齒間隙時 Piezo1 表達最高，F(xiàn)-actin 排列最整齊，且細(xì)胞 viability 超過90%。

圖 2. 梳齒間隙對細(xì)胞行為的影響分析圖

在固定梳狀結(jié)構(gòu)的情況下，改變噴嘴移動速度（10-30mm/s），通過SEM、免疫熒光和基因表達分析，研究了速度對剪切力和細(xì)胞 mechanotransduction 的影響。結(jié)果表明，20mm/s 時剪切力適中，既能促進 Piezo1 和 FAK 等基因表達，又能保持細(xì)胞 viability 高于90%，而30mm/s 時細(xì)胞 viability 顯著下降至69%。

圖3. 噴嘴移動速度對機械刺激的影響圖

對比普通打印、刀片輔助打印和梳狀輔助打印，通過F-actin染色、免疫熒光和基因表達檢測，研究了不同方法對細(xì)胞排列和 mechanotransduction 相關(guān)基因的影響。結(jié)果表明，梳狀輔助打印在 Hippo、Wnt/β-catenin 等信號通路基因表達上顯著優(yōu)于其他兩種方法，機械刺激效果最強。

圖 4. 三種生物打印方法對比分析圖

對三種打印方法制備的生物構(gòu)造進行SEM觀察、活/死染色和MTT檢測，研究了結(jié)構(gòu)完整性和細(xì)胞增殖能力。結(jié)果表明，梳狀輔助打印的構(gòu)造中膠原蛋白排列更均勻，F(xiàn)-actin 對齊度更高，細(xì)胞增殖速率顯著高于對照組。

圖 5. 生物構(gòu)造的結(jié)構(gòu)與細(xì)胞增殖分析圖

通過免疫熒光染色（MHC）、基因表達分析和力學(xué)測試，研究了生物構(gòu)造的肌生成潛力和機械性能。結(jié)果表明，梳狀輔助打印組的肌管形成更明顯，MHC 融合指數(shù)和成熟率更高，且 Young’s modulus 顯著增強。

圖6. 肌生成與機械性能評估圖

使用GelMA和dECM生物墨水進行梳狀輔助打印，通過光學(xué)顯微鏡、免疫熒光和基因表達檢測，研究了不同材料對細(xì)胞排列和機械刺激的響應(yīng)。結(jié)果表明，兩種生物墨水在梳狀輔助下均能提升 F-actin 對齊度和 Piezo1 表達，dECM 組效果更優(yōu)。

圖 7. 不同生物墨水的生物構(gòu)造分析圖

利用hASCs-laden膠原生物墨水進行梳狀輔助打印，結(jié)合3D打印的VML模型和多角度心臟肌肉構(gòu)造，研究了該技術(shù)在肌肉和心臟再生中的應(yīng)用。結(jié)果表明，梳狀輔助打印能促進hASCs向肌細(xì)胞分化，且可制備具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的折疊構(gòu)造和多角度對齊的心臟肌肉模型。

圖 8. 干細(xì)胞應(yīng)用與復(fù)雜構(gòu)造示意圖

研究結(jié)論
本研究表明，梳狀輔助生物打印可顯著改善含C2C12細(xì)胞生物墨水的生物物理特性。該方法與傳統(tǒng)及刀片輔助生物打印技術(shù)相比，不僅能促進細(xì)胞核和F-肌動蛋白纖維的優(yōu)異排列，還能實現(xiàn)更高的F-肌動蛋白重組甚至細(xì)胞增殖。這一改進歸因于梳狀結(jié)構(gòu)提供的適當(dāng)且均勻的剪切刺激，有效引導(dǎo)了細(xì)胞組織并增強了機械轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。此外，梳狀輔助生物打印方法顯著提高了C2C12成肌細(xì)胞的成肌活性，表現(xiàn)為肌管形成增加、肌球蛋白重鏈排列更好以及晚期成肌相關(guān)基因的表達升高。這些結(jié)果表明，梳狀輔助生物打印在制造具有增強結(jié)構(gòu)和功能完整性的生物工程肌肉組織方面具有廣闊前景。

文章來源：
https://doi.org/10.1080/17452759.2025.2499440